Näringsbalanserad utfodring

den viktigaste faktorn som påverkar tillväxten av magnetotaktiska bakterier, och följaktligen magnetosombildning, är koncentration av näringsämnen, särskilt kolkälla. Det var inte möjligt att förlänga optimerade medelbetingelser bestämda för MSR-1-tillväxt i skakkolvkultur direkt till massproduktionsskala fermentorkultur . Under MSR-1-kultur utövar ackumulering av överdrivna näringsämnen och hämmande komponenter i medium hastighetsbegränsande effekter på celltillväxt. Enligt Liebigs lag om Minimum begränsas biomassa i ett visst system vanligtvis av mängden av ett visst näringsämne, även när andra näringsämnen är närvarande i överskott .

en näringsbalanserad utfodringsstrategi kan minska den hämmande effekten av överdriven mängd näringsämnen i medium. I denna strategi reduceras ackumulering av Na + − och Cl-joner genom ersättning av kol-och kvävekällor. I fed-batchkultur minskar ackumulering av Na+ och Cl− joner osmotisk potential och hämmar följaktligen celltillväxt. Även en låg NaCl-koncentration (40 mM ) hämmade celltillväxt . Således kan en näringsbalanserad utfodringsstrategi öka tillväxten avsevärt.

Liu et al. , etablerade en” kemostatkultur ” -teknik för MSR-1-odling baserad på pH-stat-utfodring för att upprätthålla konsistens av kväve -, kol-och järnkoncentrationer med flera organiska syror. Mikroaerobiska förhållanden tillämpades för MSR-1-odling i ett fed-batch autofermentor-system. En näringslösning innehållande (per liter) järncitrat (4,2 g), mjölksyra (52,6 g), natriumlaktat (129 g) och NH4Cl (54,9 g) användes för pH-stat utfodring. Höga värden på magnetosomutbyte (83,23 5,36 mg L− 1) och celltillväxt (55,49 mg L− 1 dag− 1) uppnåddes vid låg natriumlaktatnivå (Tabell 1). Kemostatodlingsteknik främjar effektivt magnetosomutbyte och celltillväxt med låg tid och energikostnad. Cytotoxiska effekter observerades för överdriven koncentration av upplöst syre(20 ppb i 20-talet) och närvaron av mjölksyra i medium. Artificiella kontrollstrategier för autofermentorsystem måste justeras med avseende på cellernas fysiologiska tillstånd. På samma sätt, ormbunke eller Castan et al. , demonstrerade pH-stat fed-batch tillväxtstrategi. I denna strategi applicerades olika koncentrationer av mjölksyra (kolkälla) och natriumnitrat (elektronacceptor) i foderet. Tillväxtförhållanden och intracellulär järnkoncentration optimerades enligt biomassakoncentrationen. Den högsta koncentrationen av biomassa nådde OD565 nm = 15,50 .

Tabell 1 Utbytesproduktion av magnetosomer av magnetotaiska bakterier och deras tillstånd

MSR-1 celltillväxt och magnetosombildning är höga när natriumlaktat används som kolkälla. Å andra sidan behövs låg natriumlaktatkoncentration för att upprätthålla låg upplöst syrekoncentration för snabb celltillväxt och magnetosombildning . Att upprätthålla natriumlaktatkoncentrationen i massproduktionsskalning är svårt, och specifika utfodringsstrategier krävs därför i laboratoriet. NH4Cl har visat sig vara en bättre kvävekälla än NaNO3 .

Zhang et al. , uppnådde maximal magnetosomutbyte i MSR-1 med hjälp av en halvkontinuerlig kulturstrategi. Optimerat kolvmedium användes i 7,5-och 42-L autofermentorer, näringsbalanserad utfodringsstrategi tillämpades och kol− och kvävekällor ersattes för att minska ackumuleringen av Na+ – och Cl-joner. Den osmotiska potentialen minskade genom NA + − och Cl-jonackumulering, vilket hämmade magnetosomutbyte och celltillväxt. Vi uppnådde maximala värden i fed-batchkultur av magnetosomutbyte 356.52 mg L – 1 och celltillväxt 9,16 g L− 1 (Tabell 1).

Yang et al. , odlade AMB – 1-celler i magnetic spirillum growth medium (MSGM) berikad med L-cystein, jästextrakt och polypepton. I detta system förbättrade L-cystein celltillväxt och minskad fördröjningsfas, vilket resulterade i hög magnetosomproduktion. Tillsatsen av endast jästextrakt och polypepton resulterar i en liten produktion av magnetosomer. Jästextrakt visar ingen signifikant effekt i magnetosomproduktion, medan polypepton bara ökar den slutliga celltätheten . Orsaken till förbättrad produktion av magnetosomer av L-cystein är okänd, men det antas att magnetosomproduktion inte är associerad med lägre redoxpotentialer i närvaro av L-cystein . Dessutom kan AMB-1 växa utan tillgängliga aminosyror och l-cysteinsyntesvägar i AMB-1 kan inte vara effektiva eller relaterade till celltillväxt. Därför kan AMB – 1 direkt använda L-cystein istället för att behöva syntetisera det för att underlätta celltillväxt .

Ke et al. , odlade Magnetospirillum sp. ME – 1 i tillväxtmedium berikat med natriumacetat, natriumsuccinat, jästextrakt, MgSO4, NH4Cl och järncitrat. ME – 1 använder kolkälla för tillväxt såsom succinat, fumarat, oxaloacetat, pyruvat, acetat, laktat, malat och pepton. Dessutom kan ME-1 växa i frånvaro av kvävekälla, men NH4Cl eller NaNO3-tillskott förbättrar me-1-tillväxten. ME – 1 uppvisar ureas-och oxidasaktivitet, vilket tyder på förmågan hos aerob tillväxt, men aerobt tillstånd hämmar magnetosombildningen I ME-1 . Fed-batchjäsning av ME – 1 optimerades vid en konstant nivå av pH 6.8 i en 10-L-fermentor baserad på pH-statisk matning, samtidigt som kol -, kväve-och järnkällorna för storskalig produktion levererades (Tabell 1).

trots det höga utbytet av magnetosomer innehåller sådana utvecklade metoder för tillväxt av magnetotaktiska bakterier giftiga komponenter i tillväxtmedium. Dessa komponenter innefattar cancerframkallande, mutagena och reprotoxiska kemikalier, tungmetaller, kelateringsmedel och un-karakteriserade animaliska härledda ingredienser såsom jästextrakt . Det finns ett stort behov av att få storskalig produktion av rena magnetosomer med lägsta möjliga mängd sådana föroreningar eller giftiga komponenter (andra metaller än järn). Därför Berny et al. , utvecklat ett minimalt tillväxtmedium för produktion av magnetosomer med mindre eller saknar giftiga komponenter, och har liknande magnetosomegenskaper som de som erhållits under de bäst rapporterade tillväxtförhållandena av Zhang et al. . För det första förstärktes magnetotaktiska bakterier i förväxtmedium utan att producera magnetosomer . I andra steget matades sedan magnetotaktiska bakterier med ett järnrikt matat satsmedium innehållande för att möjliggöra magnetosomsyntes . Efter 50 timmars tillväxt nådde biomassakoncentrationen till OD565 nm = 8 och ger magnetosomer produktion av cirka 10 mg/L tillväxtmedium. En signifikant minskning / försvinnande i magnetosomsammansättningen av Zn, Mn, Ba och Al observerades . Denna nya strategi för magnetosomer produktion utan eller lägsta koncentration av andra föroreningar än järn, banar väg mot medicinska tillämpningar.

upplöst syrekoncentration

Magnetosombiosyntes kräver mikroaerobiska eller anoxiska tillstånd. Låg upplöst syre nivå påverkar signifikant celltillväxt eftersom högdensitetskultur kräver högt upplöst syre för att erhålla önskat magnetosomutbyte. Å andra sidan kan ökat upplöst syre öka MSR-1-densiteten i odlingsmedium men hämma magnetosombildning . Det finns således en konflikt mellan magnetosombildning och celltillväxt, vilket gör det svårt att samtidigt uppnå hög MSR-1-celldensitet och högt magnetosomutbyte. Denna konflikt kan lösas något genom att kontrollera upplöst syre till en optimal nivå genom justering av celltillväxthastigheten. Jajan et al. , rapporterade det minskade järnupptaget och magnetosomproduktionen vid den upplösta syrenivån över 5-10 ppm. Men när upplöst syre var lägre än 5-10 ppm ökade järnupptagningshastigheten och produktionen av magnetosomer, vilket troligen berodde på den långsamma tillväxten av bakterier . Sun et al. , etablerad masskultur av MSR – 1 för förbättrad magnetosomproduktion i en 42-L fermentor, med optimerat kolvmedium, genom att tillämpa strikta mikroaeroba förhållanden (nära noll upplöst syrekoncentration) och använda järncitrat och natriumlaktat som järn-och kolkällor i medium. Denna strategi var effektiv för utbyte odling av magnetosomer eftersom celltillväxt reglerades vid låg upplöst syre koncentration, vilket resulterar i hög magnetosomutbyte.

AMB-1 är en fakultativ anaerob magnetotaktisk bakterie som överför elektroner via två andningsvägar. Under aeroba tillväxtbetingelser använder AMB-1 syre som elektronacceptor och varken främjar eller hämmar bildandet av magnetiska partiklar. I en alternativ väg använder AMB-1 nitrat som elektronacceptor och kräver därför låga redoxpotentialer för media, vilket bidrar till magnetosombildning. I en studie av Yang et al. , magnetosomproduktionshastigheten var hög under låg upplöst syrekoncentration i vätskefas. När upplöst syre koncentration i vätskefasen översteg en viss nivå (0.20 ppm) skiftade andningsvägen till aerob tillväxt, vilket ledde till minskad magnetosomproduktion.

upplöst syrekoncentration påverkas starkt av luftflöde och omrörningshastighet. När upplöst syre under initial tillväxtfas höjs genom att öka luftflödet och omrörningshastigheterna förblir magnetosomutbytet lågt tills upplöst syre sjunker till en odetekterbar nivå. För att övervinna detta fenomen vid MSR-1-odling måste upplöst syre förbättras till en optimal nivå genom omrörning och celler får sedan minska upplöst syre genom andning tills de når den nivå som är optimal för magnetosombildning. Hög magnetosomproduktion uppnåddes genom att optimera / justera luftflödet och omrörningshastigheterna . Under den initiala odlingsfasen reducerades upplöst syre genom att bibehålla dessa hastigheter respektive vid 1 L min – 1 och 200 rpm min− 1. Under senare odlingsfas ökades upplöst syre genom att justera luftflödeshastigheten till 2 L min− 1 vid 20 h och omrörningshastigheten till 300 rpm min− 1 vid 28 h. under dessa förhållanden växte celler snabbt, upplöst syre blev odetekterbart vid 12 h och celltätheten nådde OD565 nm = 12,3 vid 36 h. natriumlaktat och järncitratkoncentrationer kontrollerades respektive i intervallet 3-6 mmol l− 1 och 70-110 kcal L− 1 under processen. Höga värden på magnetosomutbyte (83,23 5,36 mg L− 1) och produktivitet (55,49 mg L− 1 dag− 1) uppnåddes således (Tabell 1).

vid ME-1-odling kontrollerades upplöst syre för att förbättra magnetosomproduktionen vid en konstant nivå av 0,5% genom koppling till luftflödeshastigheten och omrörningshastigheten. Under Fed-satsjäsning producerade en omrörningshastighet (i intervallet 50-300 rpm) en stor mängd magnetosomer vid konstant nivå av upplöst syre (0,5%). Den resulterande celldensiteten och magnetosomutbytet vid 49 h var 6,5 (OD565) och 120 mg L− 1 (våtvikt). Denna strategi uppnådde hög magnetosomutbyte och produktivitet, vilket indikerar att ME-1 har stor potential för storskalig produktion av magnetosomer .

låga upplösta syrenivåer har fastställts empiriskt i många studier, men utan kontinuerlig mätning av upplöst syrekoncentration eller definition av dess kontroll i mediet. Heyen och Schuguiller, etablerade en metod för automatisk styrning av låg syrespänning (pO2) i MSR-1 odlingsmedium med hjälp av ett fermentorsystem för oxystat-Drift. pO2-spänningen korrelerades med magnetitbildning. Det lägsta registrerade pO2-värdet (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) var det mest gynnsamma för magnetosombildning. Celler odlade under oxystatbetingelser visade signifikant högre magnetitutbyte (6,3 mg L− 1 dag− 1) (Tabell 1).

järnjonupptag

järn krävs som en kofaktor för många enzymer, särskilt de som är involverade i stora biologiska vägar. Specifika järntransportmekanismer i celler ger järnnivåer tillräckliga för optimal tillväxt. Vissa bakterier producerar järnkelatorer (benämnda sideroforer) för att ta upp järnjärn (Fe3+). Magnetotaktiska bakterier syntetiserar magnetosomer som består av magnetit eller greigit efter att ha hittat mikroaerofila förhållanden som är lämpliga för deras tillväxt . I MSR-1 är magnetit huvudkomponenten i magnetosomer, och magnetosomproduktion påverkas därför inte signifikant av järncitratkoncentration i odlingsmedium. Jajan et al. , visade att järnsulfat var en bättre källa till järn än järnkinat och järncitrat för M. gryphiswaldense . I en studie av AMB-1, Yang et al. , använde olika järnsulfat och järnkelater som järnkällor och jämförde deras effekter. Magnetosomproduktionen förbättrades signifikant av järngallat och sulfat och påverkades också av annan järnkälla (järnkinat, järnmalat) och av järnupptagningshastighet.

järnjon (Fe3+) tas upp under dynamisk celltillväxt, och mängden som tas upp är korrelerad med magnetosombildning när upplöst syre i mediet är odetekterbart. Magnetosombildning kräver mikromolär järnkoncentration och mikrooxiska förhållanden . MSR-1-celler är icke-magnetiska under oxiska förhållanden, men börjar producera magnetit när upplöst syrekoncentration faller under ett tröskelvärde (20 mbar eller odetekterbart). I loggfasen av celltillväxt tas järnjon snabbt upp och dess absorptionshastighet är > 80% och korreleras med magnetosombildning .

Magnetosomsyntes förbrukar ATP

ATP är den universella energikällan som krävs för metabolism, molekylär transport, signaltransduktion och andra viktiga cellfysiologiska processer. Magnetosomsyntes kräver en stor mängd energi, och järnupptag beror på ATP-tillgänglighet. NADH ger en protongradient över det inre mitokondriella membranet för ATP-produktion katalyserad av ATP-syntas . NADH/ NAD + – förhållandet ökar snabbt efter magnetosommognad under loggfasen.

reducerande effekt ökar signifikant under magnetosomsyntes; emellertid kan överdriven reducerande effekt hämma magnetosomsyntes och celltillväxt . MSR – 1 kan konsumera överdriven reducerande kraft genom polyhydroxibutyrat (PHB) syntes och vätefrisättning . MSR-1-celler innehåller PHB-granuler . Knockout av PHB-syntasgen i MSR-1 resulterade i ~ 30% ökning av magnetosomantal . Energikonkurrens uppstår således mellan PHB och magnetosomsyntesprocessen. En mutant av Atpasgen av MSR och MSR-NPHB skapad genom konjugering användes som ett gentekniskt verktyg för att visa att kloramfenikolacetyltransferas (CAT) promotor ökar nedströms uttryck av Atpasgen. I jämförelse med MSR-1 visade MSR-NPHB 35% större hydrolysaktivitet, 71% lägre PHB-ackumulering, 56% större syreförbrukning och 40% större laktatförbrukning. Maximalt utbyte av MSR-NPHB i en 7,5-L bioreaktor var 58,4 6,4 mg 6,4 mg L− 1 . Dessa fynd visar att magnetosomutbytet kan förbättras och produktionskostnad och tid minskas genom genetisk manipulation av MSR-1 i kombination med optimering/ modifiering av kultur och tillväxtmedia.

Superoxiddismutasaktivitet

magnetosomsyntes är associerad med in vitro-nedbrytning av H2O2 och med skyddande effekter mot H2O2-toxicitet i celler. I mikroorganismer bryter enzymet superoxiddismutas ner H2O2 och superoxidanjonradikal (O2−), som båda har destruktiva effekter på cellmakromolekyler . I magnetotaktiska bakterier minskar superoxiddismutas också oxidativ stress under magnetosombildning. H2O2 kan bilda en hydroxylradikal efter att ha fått en elektron från järnjärn (Fe2+). Hydroxylradikal är den reaktiva syrearten (ROS) som kan skada biomolekyler . Yang et al. , visade att när tillräckligt löst syre och näringsämnen är tillgängliga i sen loggfas, kan magnetosombildning och mognad inte komma ikapp till celldelningshastighet, vilket leder till utspädning av magnetosomer. Reduktion av superoxiddismutasaktivitet kan således bero på likhet med utspädd ROS. Magnetosomer, såväl som konstgjorda magnetiska nanopartiklar , deltar i rensning av ROS, och denna aktivitet kan också leda till minskad superoxiddismutasaktivitet.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.