hrănire echilibrată cu nutrienți

factorul major care afectează creșterea bacteriilor magnetotactice și, în consecință, formarea magnetozomilor, este concentrația nutrienților, în special sursa de carbon. Nu a fost posibilă extinderea condițiilor medii optimizate determinate pentru creșterea MSR-1 în cultura shake-flask direct la cultura fermentatorului la scară de producție în masă . În timpul culturii MSR-1, acumularea de nutrienți excesivi și componente inhibitoare în mediu exercită efecte limitatoare de viteză asupra creșterii celulare. Conform Legii minime a lui Liebig, biomasa dintr-un sistem dat este de obicei restricționată de cantitatea unui anumit nutrient, chiar și atunci când alți nutrienți sunt prezenți în exces .

o strategie de hrănire echilibrată cu nutrienți poate reduce efectul inhibitor al cantității excesive de nutrienți în mediu. În această strategie, acumularea de ioni Na + și Cl – este redusă prin înlocuirea surselor de carbon și azot. În cultura loturilor hrănite, acumularea de ioni Na + și Cl-scade potențialul osmotic și, prin urmare, inhibă creșterea celulară. Chiar și o concentrație scăzută de NaCl (40 mM ) a inhibat creșterea celulelor . Astfel, o strategie de hrănire echilibrată cu nutrienți poate spori semnificativ rata de creștere.

Liu și colab. , a stabilit o tehnică de” cultură chemostat ” pentru cultivarea MSR-1 bazată pe hrănirea pH-stat pentru a menține consistența concentrațiilor de azot, carbon și fier folosind mai mulți acizi organici. Condițiile microaerobe au fost aplicate pentru cultivarea MSR-1 într-un sistem autofermentor cu lot alimentat. Pentru alimentarea cu pH-stat a fost utilizată o soluție nutritivă care conține (pe litru) citrat feric (4,2 g), acid lactic (52,6 g), lactat de sodiu (129 g) și NH4Cl (54,9 g). Valorile ridicate ale randamentului magnetozomilor (83,23 5,36 mg l− 1) și ale creșterii celulare (55,49 mg L− 1 zi− 1) au fost atinse la nivel scăzut de lactat de sodiu (Tabelul 1). Tehnica culturii Chemostat promovează eficient randamentul magnetozomilor și creșterea celulelor cu costuri reduse de timp și energie. S-au observat efecte citotoxice pentru concentrația excesivă de oxigen dizolvat (20 PPB) și prezența acidului lactic în mediu. Strategiile de control Artificial pentru sistemele autofermentoare trebuie ajustate în funcție de starea fiziologică a celulelor. În mod similar, Fern Xvndez-castan XV și colab. , a demonstrat strategia de creștere a pH-stat fed-lot. În această strategie s-au aplicat în furaj diferite concentrații de acid lactic (sursă de carbon) și azotat de sodiu (acceptor de electroni). Condițiile de creștere și concentrația intracelulară de fier au fost optimizate în funcție de concentrația de biomasă. Cea mai mare concentrație de biomasă atinsă la OD565 nm = 15,50 .

Tabelul 1 produce producția de magnetozomi de către bacteriile magnetotaice și condițiile acestora

creșterea celulelor MSR-1 și formarea magnetozomilor sunt ridicate atunci când lactatul de sodiu este utilizat ca sursă de carbon. Pe de altă parte, este necesară o concentrație scăzută de lactat de sodiu pentru a menține o concentrație scăzută de oxigen dizolvat pentru creșterea rapidă a celulelor și formarea magnetozomilor . Menținerea concentrației de lactat de sodiu în producția de masă este dificilă și, prin urmare, sunt necesare strategii specifice de hrănire în laborator. S-a dovedit că NH4Cl este o sursă de azot mai bună decât NaNO3 .

Zhang și colab. , a obținut un randament maxim de magnetozom în MSR-1 Folosind o strategie de cultură semi-continuă. Mediul de balon optimizat a fost utilizat în autofermentori de 7,5 și 42 L, S – a aplicat o strategie de hrănire echilibrată cu nutrienți, iar sursele de carbon și azot au fost înlocuite pentru a reduce acumularea de ioni Na+ și Cl -. Potențialul Osmotic a fost scăzut prin acumularea de Na+ și Cl− ion, inhibând astfel randamentul magnetozomilor și creșterea celulelor. Am obținut valori maxime în cultura loturilor hrănite a randamentului magnetozomului 356.52 mg L – 1 și creștere celulară 9,16 g L− 1 (Tabelul 1).

Yang și colab. , celule AMB-1 cultivate în mediu de creștere a spirilului magnetic (MSGM) îmbogățit cu L-cisteină, extract de drojdie și polipeptonă. În acest sistem, L-cisteina a îmbunătățit creșterea celulelor și a redus faza de întârziere, rezultând o producție ridicată de magnetozomi. Adăugarea numai a extractului de drojdie și a polipeptonei are ca rezultat producerea ușoară a magnetozomilor. Extractul de drojdie nu prezintă un efect semnificativ în producția de magnetozomi, în timp ce polipeptonul crește doar densitatea finală a celulelor . Motivul pentru îmbunătățirea producției de magnetozomi de către L-cisteină nu este cunoscut, cu toate acestea, se presupune că producția de magnetozomi nu este asociată cu potențiale redox mai mici în prezența L-cisteinei . Mai mult, AMB-1 poate crește fără aminoacizi disponibili, iar căile de sinteză a l-cisteinei în AMB-1 pot să nu fie eficiente sau legate de creșterea celulară. Prin urmare, AMB-1 poate utiliza direct L-cisteina în loc să o sintetizeze pentru a facilita creșterea celulară .

Ke și colab. , Magnetospirillum cultivat sp. ME-1 în mediu de creștere îmbogățit cu acetat de sodiu, succinat de sodiu, extract de drojdie, MgSO4, nh4cl și citrat feric. ME-1 utilizează sursa de carbon pentru creștere, cum ar fi succinat, fumarat, oxaloacetat, piruvat, acetat, lactat, malat și peptonă. În plus, ME-1 poate crește în absența sursei de azot, cu toate acestea, suplimentarea cu Nh4cl sau NaNO3 îmbunătățește creșterea ME-1. ME-1 prezintă activitate urează și oxidază, sugerând capacitatea de creștere aerobă, cu toate acestea, starea aerobă inhibă formarea magnetozomilor în ME-1 . Fermentarea în serie Fed a ME-1 a fost optimizată la un nivel constant de pH 6,8 într-un fermentator de 10 L bazat pe alimentarea statică a pH-ului, furnizând în același timp sursele de carbon, azot și fier pentru producția la scară largă (Tabelul 1).

în ciuda randamentului ridicat al magnetozomilor, astfel de metode dezvoltate pentru creșterea bacteriilor magnetotactice conțin componente toxice în mediul de creștere. Aceste componente includ substanțe chimice cancerigene, mutagene și toxice pentru reproducere, metale grele, agenți de chelare și ingrediente derivate din animale caracterizate, cum ar fi extractul de drojdie . Există o mare nevoie de a obține o producție pe scară largă de magnetozomi Puri cu cea mai mică cantitate posibilă de astfel de impurități sau componente toxice (alte metale decât fierul). Prin urmare, Berny și colab. , a dezvoltat un mediu de creștere minim pentru producția de magnetozomi cu mai puțin sau lipsit de componente toxice și având proprietăți magnetozomice similare cu cele obținute în cele mai bune condiții de creștere raportate de Zhang și colab. . În primul rând, bacteriile magnetotactice au fost amplificate în mediul de pre-creștere fără a produce magnetozomi . În a doua etapă, bacteriile magnetotactice au fost apoi hrănite cu un mediu bogat în fier, care conține pentru a permite sinteza magnetozomilor . După 50 h de creștere, concentrația biomasei a ajuns la OD565 nm = 8 și produce magnetozomi de producție de aproximativ 10 mg / L de mediu de creștere. S-a observat o reducere/Dispariție semnificativă a compoziției magnetozomice a Zn, Mn, Ba și Al . Această nouă strategie pentru producerea magnetozomilor fără sau cea mai mică concentrație de impurități, altele decât fierul, deschide calea către aplicații medicale.

concentrația de oxigen dizolvat

biosinteza Magnetozomilor necesită condiții microaerobe sau anoxice. Nivelul scăzut de oxigen dizolvat afectează în mod semnificativ creșterea celulelor, deoarece cultura de înaltă densitate necesită oxigen dizolvat ridicat pentru a obține randamentul dorit al magnetozomului. Pe de altă parte, creșterea oxigenului dizolvat poate crește densitatea MSR-1 în mediul de cultură, dar inhibă formarea magnetozomilor . Astfel, există un conflict între formarea magnetozomilor și creșterea celulelor, ceea ce face dificilă obținerea simultană a densității celulare MSR-1 ridicate și a randamentului magnetozomic ridicat. Acest conflict poate fi rezolvat oarecum prin controlul oxigenului dizolvat la un nivel optim prin ajustarea ratei de creștere a celulelor. Jajan și colab. , a raportat absorbția redusă a fierului și producția de magnetozomi la nivelul oxigenului dizolvat de peste 5-10 ppm. Cu toate acestea, atunci când oxigenul dizolvat a fost mai mic de 5-10 ppm, rata de absorbție a fierului și producția de magnetozomi au crescut, ceea ce probabil datorită creșterii lente a bacteriilor . Sun și colab. , cultura de masă stabilită a MSR-1 pentru producția îmbunătățită de magnetozomi într-un fermentator de 42 L, cu mediu de balon optimizat, prin aplicarea unor condiții microaerobe stricte (concentrație de oxigen dizolvat aproape zero) și utilizarea citratului feric și a lactatului de sodiu ca surse de fier și carbon în mediu. Această strategie a fost eficientă pentru cultivarea randamentului magnetozomilor, deoarece creșterea celulară a fost reglată la o concentrație scăzută de oxigen dizolvat, rezultând un randament ridicat al magnetozomilor.

AMB-1 este o bacterie magnetotactică anaerobă facultativă care transferă electroni prin două căi respiratorii. În condiții de creștere aerobă, AMB – 1 utilizează oxigenul ca acceptor de electroni și nici nu promovează și nici nu inhibă formarea particulelor magnetice. Într-o cale alternativă, AMB-1 folosește nitrat ca acceptor de electroni și, prin urmare, necesită potențial redox mediu scăzut, care sunt propice formării magnetozomilor. Într-un studiu realizat de Yang și colab. , rata de producție a magnetozomilor a fost ridicată sub concentrație scăzută de oxigen dizolvat în fază lichidă. Când concentrația de oxigen dizolvat în faza lichidă a depășit un anumit nivel (0.20 ppm), calea respiratorie a trecut la creșterea aerobă, ducând la reducerea producției de magnetozomi.

concentrația de oxigen dizolvat este puternic afectată de debitul de aer și de rata de agitare. Când oxigenul dizolvat în timpul fazei inițiale de creștere este crescut prin creșterea debitului de aer și a ratelor de agitare, randamentul magnetozomilor rămâne scăzut până când oxigenul dizolvat scade la un nivel nedetectabil. Pentru a depăși acest fenomen în cultivarea MSR-1, oxigenul dizolvat trebuie îmbunătățit la un nivel optim prin agitare, iar celulele apoi lăsate să reducă oxigenul dizolvat prin respirație, până la atingerea nivelului optim pentru formarea magnetozomilor. Producția ridicată de magnetozomi a fost realizată prin optimizarea/ reglarea debitului de aer și a ratelor de agitare . În timpul fazei inițiale de cultură, oxigenul dizolvat a fost redus prin menținerea acestor rate la 1 L min− 1 și respectiv 200 rpm min− 1. În timpul fazei ulterioare de cultură, oxigenul dizolvat a fost crescut prin ajustarea debitului de aer la 2 L min-1 la 20 h și a vitezei de agitare la 300 rpm min− 1 la 28 h. în aceste condiții, celulele au crescut rapid, oxigenul dizolvat devine nedetectabil la 12 h, iar densitatea celulară a atins OD565 nm = 12,3 la 36 h. lactatul de sodiu și citratul feric concentrațiile au fost controlate, respectiv, în intervalele 3-6 mmol L− 1 și 70-110 mmol L− 1 în timpul procesului. Astfel s− au atins valori ridicate ale randamentului magnetozomilor (83,23 5,36 mg l− 1) și ale productivității (55,49 mg L− 1 zi-1) (Tabelul 1).

în cultivarea ME-1, oxigenul dizolvat a fost controlat pentru a spori producția de magnetozomi la un nivel constant de 0,5% prin cuplarea la debitul de aer și rata de agitare. În timpul fermentației cu lot alimentat, o rată de agitare (în intervalul 50-300 rpm) a produs o cantitate mare de magnetozomi la un nivel constant de oxigen dizolvat (0,5%). Densitatea celulară rezultată și randamentul magnetozomilor la 49 h au fost 6,5 (OD565) și 120 mg L− 1 (greutate umedă). Această strategie a atins un randament și o productivitate ridicată a magnetozomilor, indicând astfel că ME-1 are un potențial mare pentru producția pe scară largă de magnetozomi .

nivelurile scăzute de oxigen dizolvat au fost stabilite empiric în multe studii, dar fără măsurarea continuă a concentrației de oxigen dizolvat sau definirea controlului său în mediu. Heyen și Sch Okticler au stabilit o metodă de control automat al tensiunii scăzute de oxigen (pO2) în mediul de cultură MSR-1 Folosind un sistem fermentor pentru funcționarea oxistatului. tensiunea pO2 a fost corelată cu formarea magnetitei. Cea mai mică valoare pO2 înregistrată (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) a fost cea mai favorabilă pentru formarea magnetozomilor. Celulele crescute în condiții de oxistat au prezentat un randament de magnetită semnificativ mai mare (6,3 mg L− 1 zi− 1) (Tabelul 1).

absorbția ionilor ferici

fierul este necesar ca cofactor pentru multe enzime, în special pentru cele implicate în căile biologice majore. Mecanismele specifice de transport al fierului în celule asigură niveluri de fier suficiente pentru o creștere optimă. Unele bacterii produc chelatori ferici (denumiți siderofori) pentru a prelua fierul feric (Fe3+). Bacteriile magnetotactice sintetizează magnetozomii compuși din magnetit sau greigit după ce au găsit condiții microaerofile adecvate creșterii lor . În MSR-1, magnetitul este componenta majoră a magnetozomilor, iar producția de magnetozomi nu este, prin urmare, afectată semnificativ de concentrația citratului feric în mediul de cultură. Jajan și colab. , a arătat că sulfatul feros a fost o sursă mai bună de fier decât quinatul feric și citratul feric pentru M. gryphiswaldense . Într-un studiu al AMB-1, Yang și colab. , au folosit diferiți sulfat feros și chelați ferici ca surse de fier și au comparat efectele lor. Producția de magnetozomi a fost semnificativ îmbunătățită de galat feric și sulfat și a fost, de asemenea, afectată de alte surse de fier (quinat feric, malat feric) și de rata de absorbție a fierului.

ionul feric (Fe3+) este preluat în timpul creșterii celulare dinamice, iar cantitatea preluată este corelată cu formarea magnetozomilor atunci când nivelul oxigenului dizolvat în mediu este nedetectabil. Formarea magnetozomilor necesită concentrație micromolară de fier și Condiții microoxice . Celulele MSR-1 sunt nemagnetice în condiții oxice, dar încep să producă magnetită atunci când concentrația de oxigen dizolvat scade sub o valoare de prag (20 mbar sau nedetectabilă). În faza log a creșterii celulare, ionul feric este preluat rapid, iar rata sa de absorbție este > 80% și corelată cu formarea magnetozomilor .

sinteza Magnetozomilor consumă ATP

ATP este sursa universală de energie necesară pentru metabolism, transport molecular, transducția semnalului și alte procese fiziologice celulare cruciale. Sinteza magnetozomilor necesită o cantitate mare de energie, iar absorbția fierului depinde de disponibilitatea ATP. NADH oferă un gradient de protoni pe membrana mitocondrială interioară pentru producția de ATP catalizată de ATP sintază . Raportul NADH/ NAD + crește rapid după maturizarea magnetozomilor în timpul fazei log.

puterea de reducere crește semnificativ în timpul sintezei magnetozomilor; cu toate acestea, puterea de reducere excesivă poate inhiba sinteza magnetozomilor și creșterea celulelor . MSR-1 poate consuma o putere de reducere excesivă prin sinteza polihidroxibutiratului (PHB) și eliberarea de hidrogen . Celulele MSR-1 conțin granule PHB . Eliminarea genei sintazei PHB în MSR-1 a dus la creșterea cu ~ 30% a numărului de magnetozomi . Concurența energetică are loc astfel între PHB și procesul de sinteză a magnetozomilor. Un mutant al genei ATPazei MSR și MSR-NPHB creat prin conjugare a fost utilizat ca instrument de inginerie genetică pentru a demonstra că promotorul cloramfenicol acetiltransferazei (CAT) crește expresia în aval a genei ATPazei. În comparație cu MSR-1, MSR-NPHB a prezentat o activitate de hidroliză cu 35% mai mare, o acumulare PHB cu 71% mai mică, un consum de oxigen cu 56% mai mare și un consum de lactat cu 40% mai mare. Randamentul maxim al MSR-NPHB într-un bioreactor de 7,5 L a fost de 58,4 6,4 mg l-1. Aceste descoperiri demonstrează că randamentul magnetozomilor poate fi îmbunătățit, iar costul de producție și timpul redus, prin manipularea genetică a MSR-1 în combinație cu optimizarea/ modificarea culturii și a mediilor de creștere.

activitatea superoxid dismutazei

sinteza Magnetozomilor este asociată cu descompunerea in vitro a H2O2 și cu efecte protectoare împotriva toxicității H2O2 în celule. În microorganisme, enzima superoxid dismutază descompune H2O2 și radicalul anionic superoxid (O2−), ambele având efecte distructive asupra macromoleculelor celulare . În bacteriile magnetotactice, superoxid dismutaza reduce, de asemenea, stresul oxidativ în timpul formării magnetozomilor. H2O2 poate forma un radical hidroxil după primirea unui electron din fier feros (Fe2+). Radicalul hidroxil este specia reactivă de oxigen (ROS) care poate deteriora biomoleculele . Yang și colab. , a demonstrat că atunci când suficient oxigen dizolvat și substanțe nutritive sunt disponibile în faza log târzie, formarea și maturarea magnetozomilor nu sunt în măsură să ajungă la rata de diviziune celulară, ducând la diluarea magnetozomilor. Reducerea activității superoxid dismutazei poate rezulta astfel din similitudinea ROS diluat. Magnetozomii, precum și nanoparticulele magnetice artificiale, participă la curățarea ROS , iar această activitate poate duce, de asemenea, la reducerea activității superoxid dismutazei.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.