de Nutrientes-alimentação equilibrada

O principal fator afetando o crescimento de magnetotactic bactérias e, consequentemente, magnetosome formação, é a concentração de nutrientes, especialmente fonte de carbono. Não foi possível estender as condições médias otimizadas determinadas para o crescimento de MSR-1 na cultura de balão de agitação diretamente para a cultura fermentadora em escala de produção em massa . Durante a cultura MSR-1, o acúmulo de nutrientes excessivos e componentes inibitórios em meio exerce efeitos limitantes da taxa no crescimento celular. De acordo com a Lei do mínimo de Liebig, a biomassa em um determinado sistema é tipicamente restrita pela quantidade de um nutriente em particular, mesmo quando outros nutrientes estão presentes em excesso .

uma estratégia alimentar equilibrada em nutrientes pode reduzir o efeito inibitório da quantidade excessiva de nutrientes em meio. Nesta estratégia, o acúmulo de íons Na+ e Cl− é reduzido pela substituição de fontes de carbono e nitrogênio. Na cultura de lotes alimentados, o acúmulo de íons Na+ e Cl-diminui o potencial osmótico e, consequentemente, inibe o crescimento celular. Mesmo uma baixa concentração de NaCl (40 mM ) inibiu o crescimento celular . Assim, uma estratégia de alimentação equilibrada em nutrientes pode aumentar significativamente a taxa de crescimento.

Liu et al. , estabeleceu uma técnica de “cultura chemostat” para o cultivo de MSR-1 com base na alimentação de pH-stat para manter a consistência das concentrações de nitrogênio, carbono e ferro usando vários ácidos orgânicos. Condições microaeróbicas foram aplicadas para o cultivo de MSR-1 em um sistema autofermentor de lote alimentado. Uma solução nutritiva contendo (por litro) citrato férrico (4,2 g), ácido láctico (52,6 g), lactato de sódio (129 g) e NH4Cl (54,9 g) foi usada para alimentação de pH-stat. Altos valores de rendimento do magnetossoma (83,23 ± 5,36 mg L− 1) e crescimento celular (55,49 mg L− 1 dia− 1) foram alcançados com baixo nível de lactato de sódio (Tabela 1). A técnica de cultura Chemostat promove eficientemente o rendimento do magnetossoma e o crescimento celular com baixo tempo e custo de energia. Efeitos citotóxicos foram observados para concentração excessiva de oxigênio dissolvido (≥20 ppb) e presença de ácido láctico em meio. Estratégias de Controle Artificial para sistemas de autofermentor devem ser ajustadas em relação à condição fisiológica das células. Da mesma forma, Fernández-Castané et al. , demonstrou a estratégia de crescimento fed-batch pH-stat. Nesta estratégia, várias concentrações do ácido láctico (fonte de carbono) e nitrato de sódio (aceitador de elétrons) foram aplicadas na ração. As condições de crescimento e a concentração intracelular de ferro foram otimizadas de acordo com a concentração de biomassa. A maior concentração de biomassa atingiu OD565 nm = 15,50 .

Tabela 1 Produção de produção de magnetossomos por bactérias magnetotaicas e suas condições

o crescimento celular MSR-1 e a formação de magnetossomos são altos quando o lactato de sódio é usado como fonte de carbono. Por outro lado, a baixa concentração de lactato de sódio é necessária para manter a baixa concentração de oxigênio dissolvido para o rápido crescimento celular e formação de magnetossomos . Manter a concentração de lactato de sódio na escala de produção em massa é difícil, e estratégias específicas de alimentação são, portanto, necessárias no laboratório. NH4Cl foi mostrado para ser uma fonte melhor do nitrogênio do que NaNO3.

Zhang et al. , alcançou o rendimento máximo do magnetossomo no MSR-1 usando uma estratégia de cultura semi-contínua. O meio balão otimizado foi usado em autofermentores de 7,5 e 42 L, estratégia de alimentação balanceada por nutrientes foi aplicada e fontes de carbono e nitrogênio foram substituídas para reduzir o acúmulo de íons Na+ e Cl−. O potencial osmótico foi diminuído pelo acúmulo de íons Na+ e Cl, inibindo assim o rendimento do magnetossomo e o crescimento celular. Alcançamos valores máximos na cultura de lotes alimentados de rendimento de magnetossomo 356.52 mg L− 1 e crescimento celular 9,16 g L – 1 (Tabela 1).

Yang et al. , células AMB-1 cultivadas em meio de crescimento de espirilo magnético (MSGM) enriquecido com L-cisteína, extrato de levedura e polipeptona. Neste sistema, a L-cisteína aumentou o crescimento celular e reduziu a fase de atraso, resultando em alta produção de magnetossomos. A adição de apenas extrato de levedura e polipeptona resulta em uma produção leve de magnetossomos. O extrato de levedura não exibe nenhum efeito significativo na produção de magnetossomos, enquanto a polipeptona só aumenta a densidade celular final . A razão para uma melhor produção de magnetossomos pela L-cisteína é desconhecida, no entanto, supõe-se que a produção de magnetossomos não esteja associada a potenciais redox mais baixos na presença de L-cisteína . Além disso, o AMB-1 pode crescer sem aminoácidos disponíveis e as vias de síntese de L-cisteína no AMB-1 podem não ser eficientes ou relacionadas ao crescimento celular. Portanto, AMB – 1 pode usar diretamente L-cisteína em vez de ter que sintetizá-lo para facilitar o crescimento celular .

Ke et al. , Magnetospirillum cultivado sp. ME-1 em meio de crescimento enriquecido com acetato de sódio, succinato de sódio, extrato de levedura, MgSO4, NH4Cl e citrato férrico. ME-1 utiliza a fonte do carbono para o crescimento tal como o succinate, o fumarato, o oxaloacetate, o piruvato, o acetato, o lactato, o malato e o peptone. Além disso, o ME-1 pode crescer na ausência de fonte de nitrogênio, no entanto, a suplementação de NH4Cl ou NaNO3 aumenta o crescimento do ME-1. Me-1 exibem atividade de urease e oxidase, sugerindo a capacidade de crescimento aeróbico, no entanto, a condição aeróbica inibe a formação de magnetossomos em ME-1 . A fermentação em lote alimentado de ME-1 foi otimizada em um nível constante de pH 6,8 em um fermentador de 10 L baseado em alimentação pH-estática, enquanto fornece as fontes de carbono, nitrogênio e ferro para produção em larga escala (Tabela 1).

apesar do alto rendimento dos magnetossomos, tais métodos desenvolvidos para o crescimento de bactérias magnetotáticas contêm componentes tóxicos no meio de crescimento. Esses componentes incluem substâncias químicas cancerígenas, mutagênicas e reprotóxicas, metais pesados, agentes quelantes e ingredientes derivados de animais não caracterizados, como extrato de levedura . Há uma grande necessidade de obter produção em larga escala de magnetossomos puros com menor quantidade possível de tais impurezas ou componentes tóxicos (outros metais que não o ferro). Portanto, Berny et al. , desenvolveu um meio de crescimento mínimo para a produção de magnetossomos com menos ou desprovido de componentes tóxicos e com propriedades magnetossomas semelhantes às obtidas nas melhores condições de crescimento relatadas por Zhang et al. . Em primeiro lugar, as bactérias magnetotáticas foram amplificadas em meio de pré-crescimento sem produzir magnetossomos . Na segunda etapa, as bactérias magnetotáticas foram então alimentadas com um meio de lote alimentado rico em ferro contendo para permitir a síntese de magnetossomos . Após 50 H de crescimento, a concentração de biomassa atingiu OD565 nm = 8 e a produção de magnetossomos de rendimento de cerca de 10 mg/L de meio de crescimento. Observou-se redução/desaparecimento significativo na composição do magnetossoma de Zn, Mn, Ba e Al . Esta nova estratégia para a produção de magnetossomos sem ou menor concentração de impurezas que não o ferro, abre caminho para aplicações médicas.

concentração de oxigênio dissolvido

a biossíntese de Magnetossomos requer condições microaeróbicas ou anóxicas. O baixo nível de oxigênio dissolvido afeta significativamente o crescimento celular porque a cultura de alta densidade requer alto oxigênio dissolvido para obter o rendimento desejado do magnetossomo. Por outro lado, o aumento do oxigênio dissolvido pode aumentar a densidade de MSR-1 no meio de cultura, mas inibir a formação de magnetossomos . Existe, portanto, um conflito entre a formação do magnetossomo e o crescimento celular, dificultando a obtenção simultânea de alta densidade celular MSR-1 e alto rendimento do magnetossomo. Esse conflito pode ser resolvido um pouco controlando o oxigênio dissolvido para um nível ideal por meio do ajuste da taxa de crescimento celular. Jajan et al. , relatou a absorção reduzida de ferro e a produção de magnetossomos no nível de oxigênio dissolvido acima de 5-10 ppm. No entanto, quando o oxigênio dissolvido foi inferior a 5-10 ppm, a taxa de absorção de ferro e a produção de magnetossomos foram aumentadas, o que provavelmente devido ao lento crescimento de bactérias . Sun et al. , cultura de massa estabelecida de MSR-1 para a produção aumentada do magnetosome em um fermentador 42-L, com meio aperfeiçoado da garrafa, aplicando circunstâncias microaerobic restritas (concentração dissolvida próximo-zero do oxigênio) e usando o citrato férrico e o lactato de sódio como fontes do ferro e do carbono no meio. Essa estratégia foi eficaz para o cultivo de magnetossomos porque o crescimento celular foi regulado com baixa concentração de oxigênio dissolvido, resultando em alto rendimento de magnetossomos.

AMB-1 é uma bactéria magnetotática anaeróbica facultativa que transfere elétrons através de duas vias respiratórias. Sob condições de crescimento aeróbico, o AMB-1 utiliza oxigênio como aceitador de elétrons e não promove nem inibe a formação de partículas magnéticas. Em uma via alternativa, AMB-1 usa nitrato como aceitador de elétrons e, portanto, requer Baixos potenciais redox de mídia, que são propícios à formação de magnetossomos. Em um estudo de Yang et al. , a taxa de produção de magnetossomos foi alta sob baixa concentração de oxigênio dissolvido na fase líquida. Quando a concentração de oxigênio dissolvido na fase líquida excedeu um certo nível (0.20 ppm), a via respiratória mudou para o crescimento aeróbico, levando à redução da produção de magnetossomos.

a concentração de oxigênio dissolvido é fortemente afetada pela taxa de fluxo de ar e taxa de agitação. Quando o oxigênio dissolvido durante a fase inicial de crescimento é aumentado aumentando o fluxo de ar e as taxas de agitação, o rendimento do magnetossomo permanece baixo até que o oxigênio dissolvido diminua para um nível indetectável. Para superar esse fenômeno no cultivo de MSR-1, o oxigênio dissolvido deve ser aprimorado para um nível ideal, mexendo, e as células podem reduzir o oxigênio dissolvido através da respiração, até atingir o nível ideal para a formação de magnetossomos. A alta produção de magnetossomos foi alcançada otimizando / ajustando o fluxo de ar e as taxas de agitação . Durante a fase inicial de cultura, o oxigênio dissolvido foi reduzido mantendo essas taxas respectivamente em 1 L min-1 e 200 rpm min− 1. Durante mais tarde, a cultura de fase, o oxigênio dissolvido foi aumentado pelo ajuste de taxa de fluxo de ar de 2 L min− 1, às 20 h e mexendo taxa de 300 rpm min− 1 em 28 h. Sob essas condições, as células crescem rapidamente, oxigênio dissolvido tornar-se indetectável às 12 h, e a densidade celular chegou OD565 nm = 12.3 36 h. Lactato de sódio e o citrato férrico concentrações foram controladas, respectivamente, em intervalos de 3 a 6 mmol L− 1 e 70-110 µmol L− 1, durante o processo. Foram alcançados altos valores de rendimento do magnetossoma (83,23 ± 5,36 mg L− 1) e produtividade (55,49 mg L− 1 dia− 1) (Tabela 1).

no cultivo de me-1, o oxigênio dissolvido foi controlado para aumentar a produção de magnetossomos em um nível constante de 0,5%, acoplando-se à taxa de fluxo de ar e taxa de agitação. Durante a fermentação em lote alimentado, uma taxa de agitação (na faixa de 50-300 rpm) produziu uma grande quantidade de magnetossomos em nível constante de oxigênio dissolvido (0,5%). A densidade celular resultante e o rendimento do magnetossoma a 49 h foram 6,5 (OD565) e 120 mg L− 1 (peso úmido). Essa estratégia alcançou alto rendimento e produtividade de magnetossomos, indicando que o ME-1 tem grande potencial para a produção em larga escala de magnetossomos .

baixos níveis de oxigênio dissolvido foram estabelecidos empiricamente em muitos estudos, mas sem medição contínua da concentração de oxigênio dissolvido ou definição de seu controle no meio. Heyen e Schüler, estabeleceram um método para o controle automático da baixa tensão do oxigênio (pO2) no meio de cultura MSR-1 usando um sistema do fermentador para a operação do oxystat. a tensão pO2 foi correlacionada com a formação de magnetita. O menor valor de pO2 registrado (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) foi o mais favorável para a formação de magnetossomos. As células cultivadas em condições de oxistato apresentaram rendimento de magnetita significativamente maior (6,3 mg L− 1 dia− 1) (Tabela 1).

a absorção de íons férricos

o ferro é necessário como cofator para muitas enzimas, particularmente aquelas envolvidas nas principais vias biológicas. Mecanismos específicos de transporte de ferro nas células fornecem níveis de ferro suficientes para um crescimento ideal. Algumas bactérias produzem quelantes férricos (denominados sideróforos) para absorver ferro férrico (Fe3+). As bactérias magnetotácticas sintetizam magnetossomos compostos de magnetita ou greigita depois de encontrar condições microaerofílicas adequadas ao seu crescimento . No MSR-1, a magnetita é o principal componente dos magnetossomos e, portanto, a produção de magnetossomos não é significativamente afetada pela concentração de citrato férrico no meio de cultura. Jajan et al. , mostrou que o sulfato ferroso era uma fonte melhor de ferro do que o quinato férrico e o citrato férrico para M. gryphiswaldense . Em um estudo de AMB-1, Yang et al. , usou vários sulfato ferroso e quelatos férricos como fontes de ferro e comparou seus efeitos. A produção de magnetossomos foi significativamente aumentada por galato férrico e sulfato, e também foi afetada por outra fonte de ferro (quinato férrico, malato férrico) e pela taxa de absorção de ferro.

O íon férrico (Fe3+) é absorvido durante o crescimento celular dinâmico, e a quantidade absorvida está correlacionada com a formação de magnetossomos quando o nível de oxigênio dissolvido no meio é indetectável. A formação de magnetossomos requer concentração de ferro micromolar e Condições microóxicas . As células MSR-1 são não magnéticas em condições oxicas, mas começam a produzir magnetita quando a concentração de oxigênio dissolvido cai abaixo de um valor limite (20 mbar ou indetectável). Na fase log do crescimento celular, o íon férrico é absorvido rapidamente e sua taxa de absorção é > 80% e correlacionada com a formação de magnetossomos .

a síntese de Magnetossomos consome ATP

o ATP é a fonte de energia universal necessária para o metabolismo, transporte molecular, transdução de sinal e outros processos fisiológicos celulares cruciais. A síntese de magnetossomos requer uma grande quantidade de energia, e a absorção de ferro depende da disponibilidade de ATP. NADH fornece um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna para a produção de ATP catalisada pela ATP sintase . A relação NADH / NAD+ aumenta rapidamente após a maturação do magnetossoma durante a fase log.

a redução da potência aumenta significativamente durante a síntese do magnetossomo; no entanto, a redução excessiva da potência pode inibir a síntese do magnetossomo e o crescimento celular . MSR-1 pode consumir o poder de diminuição excessivo com a síntese do polyhydroxybutyrate (PHB) e a liberação do hidrogênio . As células MSR-1 contêm grânulos de PHB . O nocaute do gene da sintase PHB no MSR-1 resultou em um aumento de ~ 30% do número de magnetossomos . Assim, a competição energética ocorre entre o PHB e o processo de síntese do magnetossoma. Um mutante do gene ATPase de MSR e MSR-NPHB criado por conjugação foi usado como uma ferramenta de engenharia genética para demonstrar que o promotor de cloranfenicol acetiltransferase (CAT) aumenta a expressão a jusante do gene ATPase. Em comparação com o MSR-1, o MSR-NPHB apresentou atividade de hidrólise 35% maior, acúmulo de PHB 71% menor, consumo de oxigênio 56% maior e consumo de lactato 40% maior. O rendimento máximo de MSR-NPHB em um biorreator de 7,5 L foi de 58,4 ± 6,4 mg L-1 . Estes resultados demonstram que o rendimento do magnetossoma pode ser aumentado, e o custo de produção e o tempo reduzidos, com a manipulação genética de MSR-1 em combinação com a otimização/ modificação da cultura e dos meios do crescimento.

a atividade da superóxido dismutase

a síntese do Magnetossoma está associada à degradação in vitro do H2O2 e aos efeitos protetores contra a toxicidade do H2O2 nas células. Nos microrganismos, a enzima superóxido dismutase decompõe o radical H2O2 e o ânion superóxido (O2−), ambos com efeitos destrutivos nas macromoléculas celulares . Em bactérias magnetotáticas, a superóxido dismutase também reduz o estresse oxidativo durante a formação do magnetossoma. H2O2 pode formar um radical hidroxila após receber um elétron de ferro ferroso (Fe2+). O radical hidroxila é a espécie reativa de oxigênio (ROS) que pode danificar biomoléculas . Yang et al. , demonstrou que quando oxigênio dissolvido suficiente e nutrientes estão disponíveis na fase log tardia, a formação e maturação do magnetossomo são incapazes de alcançar a taxa de divisão celular, levando à diluição dos magnetossomos. A redução da atividade da superóxido dismutase pode, portanto, resultar da semelhança de ROS diluídos. Os magnetossomos, bem como as nanopartículas magnéticas artificiais , participam da eliminação de ROS, e essa atividade também pode levar à redução da atividade da superóxido dismutase.

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