żywienie zrównoważone pod względem składników odżywczych

głównym czynnikiem wpływającym na wzrost bakterii magnetotaktycznych, a w konsekwencji na powstawanie magnetosomów, jest koncentracja składników odżywczych, w szczególności źródła węgla. Nie można było bezpośrednio rozszerzyć zoptymalizowanych warunków średnich ustalonych dla wzrostu MSR-1 w hodowli kolb szejkowych na hodowlę fermentorową na skalę masową . Podczas hodowli MSR-1 nagromadzenie nadmiernych składników odżywczych i składników hamujących w pożywce wywiera ograniczający szybkość wpływ na wzrost komórek. Zgodnie z prawem Minimum Liebiga biomasa w danym systemie jest zazwyczaj ograniczona przez ilość jednego konkretnego składnika odżywczego, nawet gdy inne składniki odżywcze są obecne w nadmiarze .

zrównoważona odżywczo strategia żywienia może zmniejszyć działanie hamujące nadmiernej ilości składników odżywczych w pożywce. W tej strategii akumulacja jonów Na+ i Cl-jest zmniejszona przez zastąpienie źródeł węgla i azotu. W hodowli fed-batch akumulacja jonów Na+ i CL− zmniejsza potencjał osmotyczny i w konsekwencji hamuje wzrost komórek. Nawet niskie stężenie NaCl (40 mM ) hamowało wzrost komórek . Tak więc zrównoważona odżywczo strategia żywienia może znacznie zwiększyć tempo wzrostu.

, ustanowił technikę” Kultury chemostatu ” dla uprawy MSR-1 w oparciu o podawanie pH-stat w celu utrzymania spójności stężeń azotu, węgla i żelaza przy użyciu kilku kwasów organicznych. W uprawie MSR-1 zastosowano warunki mikroaerobowe w systemie autofermentacji wsadowej. Do podawania pH-stat zastosowano roztwór odżywczy zawierający (na litr) cytrynian żelaza (4,2 g), kwas mlekowy (52,6 g), Mleczan sodu (129 g) i NH4Cl (54,9 g). Wysokie wartości wydajności magnetosomów (83,23 ± 5,36 mg L− 1) i wzrostu komórek (55,49 mg L− 1 dzień− 1) uzyskano przy niskim poziomie mleczanu sodu (Tabela 1). Technika hodowli chemostatu skutecznie promuje wydajność magnetosomów i wzrost komórek przy niskim czasie i kosztach energii. Obserwowano działanie cytotoksyczne w przypadku nadmiernego stężenia rozpuszczonego tlenu (≥20 ppb) i obecności kwasu mlekowego w pożywce. Strategie sztucznej kontroli układów autofermentacyjnych muszą być dostosowane do stanu fizjologicznego komórek. Podobnie Fernández-Castané et al. , zademonstrował strategię wzrostu pH-stat fed-batch. W tej strategii zastosowano różne stężenia kwasu mlekowego (źródło węgla) i azotanu sodu (akceptor elektronów) w paszy. Warunki wzrostu i wewnątrzkomórkowe stężenie żelaza zostały zoptymalizowane w zależności od stężenia biomasy. Najwyższe stężenie biomasy osiągnęło OD565 nm = 15,50 .

Tabela 1 Produkcja magnetosomów przez bakterie magnetotajne i ich warunki

wzrost komórek MSR – 1 i tworzenie magnetosomów są wysokie, gdy Mleczan sodu jest używany jako źródło węgla. Z drugiej strony, niskie stężenie mleczanu sodu jest potrzebne do utrzymania niskiego stężenia rozpuszczonego tlenu w celu szybkiego wzrostu komórek i tworzenia magnetosomów . Utrzymanie stężenia mleczanu sodu w masowej produkcji jest trudne, dlatego w laboratorium wymagane są specjalne strategie żywienia. Wykazano, że NH4Cl jest lepszym źródłem azotu niż NaNO3.

, osiągnąć maksymalną wydajność magnetosomów w MSR-1 przy użyciu półciągłej strategii hodowli. W autofermentorach 7,5-i 42-litrowych zastosowano zoptymalizowaną pożywkę kolbową, zastosowano zrównoważoną strategię żywienia oraz wymieniono źródła węgla i azotu w celu zmniejszenia akumulacji jonów Na+ i Cl -. Potencjał osmotyczny zmniejszał się w wyniku akumulacji jonów Na+ i Cl -, hamując w ten sposób wydajność magnetosomów i wzrost komórek. Osiągnęliśmy maksymalne wartości w hodowli wsadowej magnetosomu o wydajności 356.52 mg L− 1 i wzrost komórek 9,16 g L-1 (Tabela 1).

, hodowane komórki AMB-1 w magnetycznym medium wzrostu spirillum (MSGM) wzbogacone L-cysteiną, ekstraktem drożdżowym i polipeptonem. W tym układzie L-cysteina zwiększała wzrost komórek i zmniejszała fazę lag, co skutkowało wysoką produkcją magnetosomów. Dodanie tylko ekstraktu drożdżowego i polipeptonu powoduje nieznaczną produkcję magnetosomów. Ekstrakt drożdżowy nie wykazuje znaczącego wpływu na produkcję magnetosomów, podczas gdy polipepton tylko zwiększa gęstość komórek końcowych . Przyczyna poprawy produkcji magnetosomów przez L-cysteinę nie jest znana, jednak przyjmuje się, że produkcja magnetosomów nie jest związana z niższym potencjałem redoks w obecności L-cysteiny . Co więcej, AMB-1 może rosnąć bez dostępnych aminokwasów, a ścieżki syntezy L-cysteiny w AMB-1 mogą nie być wydajne lub związane ze wzrostem komórki. Dlatego AMB-1 może bezpośrednio używać L-cysteiny zamiast jej syntezy w celu ułatwienia wzrostu komórek .

, „Magnetospirillum” Sp. ME-1 w pożywce wzbogaconej octanem sodu, bursztynianem sodu, ekstraktem drożdżowym, MgSO4, NH4Cl i cytrynianem żelaza. ME-1 wykorzystuje źródło węgla do wzrostu, takie jak bursztynian, fumaran, szczawiooctan, pirogronian, octan, mleczan, jabłczan i pepton. Ponadto ME-1 może rosnąć w przypadku braku źródła azotu, jednak suplementacja NH4Cl lub NaNO3 wzmacnia wzrost ME-1. ME-1 wykazuje aktywność ureazy i oksydazy, co sugeruje zdolność wzrostu tlenowego, jednak stan tlenowy hamuje tworzenie magnetosomów w ME-1 . Fermentacja wsadowa ME-1 została zoptymalizowana na stałym poziomie pH 6,8 w 10-litrowym fermentorze w oparciu o statyczne podawanie pH, dostarczając jednocześnie źródła węgla, azotu i żelaza do produkcji na dużą skalę (Tabela 1).

pomimo wysokiej wydajności magnetosomów, tak opracowane metody wzrostu bakterii magnetotaktycznych zawierają toksyczne składniki w podłożu wzrostowym. Składniki te obejmują rakotwórcze, mutagenne i reprotoksyczne chemikalia, metale ciężkie, czynniki chelatujące i nie scharakteryzowane składniki pochodzenia zwierzęcego, takie jak ekstrakt drożdżowy . Istnieje wielka potrzeba uzyskania produkcji na dużą skalę czystych magnetosomów o jak najmniejszej ilości takich zanieczyszczeń lub składników toksycznych (innych metali niż żelazo). Dlatego Berny et al. , opracował Minimalne podłoże wzrostu do produkcji magnetosomów o mniejszej lub pozbawionej toksycznych składników i o podobnych właściwościach magnetosomów, jak te uzyskane w najlepiej zgłoszonych warunkach wzrostu przez Zhang et al. . Po pierwsze, bakterie magnetotaktyczne zostały amplifikowane w podłożu przed wzrostem bez wytwarzania magnetosomów . W drugim etapie bakterie magnetotaktyczne były następnie karmione pożywką bogatą w żelazo, zawierającą w celu umożliwienia syntezy magnetosomów . Po 50 godzinach wzrostu stężenie biomasy osiągnęło OD565 nm = 8 i dało magnetosomom produkcję około 10 mg / l pożywki wzrostowej. Zaobserwowano znaczne zmniejszenie / zanik składu magnetosomów Zn, Mn, Ba i Al. Ta nowa strategia produkcji magnetosomów bez lub najniższego stężenia zanieczyszczeń innych niż żelazo, toruje drogę do zastosowań medycznych.

stężenie rozpuszczonego tlenu

Biosynteza Magnetosomu wymaga warunków mikroaerobowych lub beztlenowych. Niski poziom rozpuszczonego tlenu znacząco wpływa na wzrost komórek, ponieważ hodowla o wysokiej gęstości wymaga wysokiego rozpuszczonego tlenu w celu uzyskania pożądanej wydajności magnetosomów. Z drugiej strony, zwiększony rozpuszczony tlen może zwiększać gęstość MSR – 1 w pożywce hodowlanej, ale hamować powstawanie magnetosomów . Istnieje zatem konflikt między tworzeniem magnetosomów a wzrostem komórek, co utrudnia jednoczesne osiągnięcie wysokiej gęstości komórek MSR – 1 i wysokiej wydajności magnetosomów. Konflikt ten można rozwiązać nieco przez kontrolowanie rozpuszczonego tlenu do optymalnego poziomu poprzez dostosowanie tempa wzrostu komórek. Jajan i in. , odnotowano zmniejszenie wychwytu żelaza i produkcji magnetosomów przy poziomie rozpuszczonego tlenu powyżej 5-10 ppm. Jednak gdy rozpuszczony tlen był niższy niż 5-10 ppm, zwiększono szybkość wchłaniania żelaza i produkcję magnetosomów, co prawdopodobnie było spowodowane powolnym rozwojem bakterii . Sun et al. , ustalono hodowlę masową MSR – 1 w celu zwiększenia produkcji magnetosomów w 42-litrowym fermentorze, z zoptymalizowanym podłożem kolby, stosując surowe warunki mikroaerobowe (prawie zerowe stężenie rozpuszczonego tlenu) i stosując cytrynian żelaza i mleczan sodu jako źródła żelaza i węgla w pożywce. Strategia ta była skuteczna w uprawie plonów magnetosomów, ponieważ wzrost komórek był regulowany przy niskim stężeniu rozpuszczonego tlenu, co skutkowało wysoką wydajnością magnetosomów.

AMB-1 jest beztlenową bakterią magnetotaktyczną, która przenosi elektrony przez dwa drogi oddechowe. W warunkach wzrostu tlenowego AMB-1 wykorzystuje tlen jako akceptor elektronów i nie promuje ani nie hamuje tworzenia się cząstek magnetycznych. W alternatywnym szlaku AMB-1 wykorzystuje azotan jako akceptor elektronów i dlatego wymaga niskiego potencjału redoks mediów, które sprzyjają tworzeniu magnetosomów. W badaniu przeprowadzonym przez Yang et al. , szybkość produkcji magnetosomów była wysoka przy niskim stężeniu tlenu rozpuszczonego w fazie ciekłej. Gdy stężenie tlenu rozpuszczonego w fazie ciekłej przekroczyło pewien poziom (0.20 ppm), droga oddechowa przesunięta w kierunku wzrostu tlenowego, co prowadzi do zmniejszenia produkcji magnetosomów.

stężenie rozpuszczonego tlenu ma duży wpływ na szybkość przepływu powietrza i szybkość mieszania. Gdy rozpuszczony tlen podczas początkowej fazy wzrostu jest podnoszony przez zwiększenie przepływu powietrza i szybkości mieszania, wydajność magnetosomu pozostaje niska, dopóki rozpuszczony tlen nie spadnie do niewykrywalnego poziomu. Aby przezwyciężyć to zjawisko w uprawie MSR – 1, rozpuszczony tlen musi zostać zwiększony do optymalnego poziomu przez mieszanie, a następnie komórki mogą redukować rozpuszczony tlen poprzez oddychanie, aż do osiągnięcia poziomu optymalnego dla tworzenia magnetosomów. Wysoka produkcja magnetosomów została osiągnięta poprzez optymalizację / regulację przepływu powietrza i szybkości mieszania . W początkowej fazie hodowli rozpuszczony tlen zmniejszano, utrzymując te szybkości odpowiednio na poziomie 1 L min-1 i 200 obr. / min− 1. Podczas późniejszej fazy hodowli, rozpuszczony tlen zwiększano przez dostosowanie szybkości przepływu powietrza do 2 L min− 1 po 20 godz. i szybkości mieszania do 300 obr. / min− 1 po 28 godz. w tych warunkach komórki szybko rosły, rozpuszczony tlen stał się niewykrywalny po 12 godz., a gęstość komórek osiągnęła od565 nm = 12,3 po 36 godz. stężenia mleczanu sodu i cytrynianu żelaza kontrolowano odpowiednio w zakresach 3-6 mmol L− 1 i 70-110 µmol L− 1 podczas procesu. W ten sposób uzyskano wysokie wartości wydajności magnetosomów (83,23 ± 5,36 mg L− 1) i wydajności (55,49 mg L− 1 dzień− 1) (Tabela 1).

w uprawie ME-1 kontrolowano rozpuszczony tlen w celu zwiększenia produkcji magnetosomów na stałym poziomie 0,5% przez sprzężenie z szybkością przepływu powietrza i szybkością mieszania. Podczas fermentacji wsadowej szybkość mieszania (w zakresie 50-300 obr. / min) wytwarzała dużą ilość magnetosomów przy stałym poziomie rozpuszczonego tlenu (0,5%). Uzyskana gęstość komórek i wydajność magnetosomów po 49 godzinach wynosiły 6,5 (OD565) i 120 mg L-1 (masa mokra). Strategia ta osiągnęła wysoką wydajność i produktywność magnetosomów, co wskazuje, że ME – 1 ma duży potencjał do produkcji magnetosomów na dużą skalę .

niskie poziomy tlenu rozpuszczonego zostały ustalone empirycznie w wielu badaniach, ale bez ciągłego pomiaru stężenia tlenu rozpuszczonego lub definicji jego kontroli w medium. Heyen i Schüler opracowali metodę automatycznej kontroli niskiego napięcia tlenu (pO2) w środowisku hodowlanym MSR-1 przy użyciu systemu fermentora do pracy z oksystatem. napięcie pO2 było skorelowane z powstawaniem magnetytu. Najniższa zanotowana wartość pO2 (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) była najbardziej korzystna dla powstawania magnetosomów. Komórki hodowane w Warunkach oksystatu wykazywały znacznie większą wydajność magnetytu (6,3 mg L− 1 dzień− 1) (Tabela 1).

wychwyt jonów żelaza

żelazo jest wymagane jako kofaktor dla wielu enzymów, szczególnie tych zaangażowanych w główne szlaki biologiczne. Specyficzne mechanizmy transportu żelaza w komórkach zapewniają poziom żelaza wystarczający do optymalnego wzrostu. Niektóre bakterie wytwarzają chelatory żelazowe (zwane sideroforami), aby pobierać żelazo (Fe3+). Bakterie magnetotaktyczne syntetyzują magnetosomy złożone z magnetytu lub greigitu po znalezieniu warunków mikroaerofilnych odpowiednich do ich wzrostu . W MSR-1, magnetyt jest głównym składnikiem magnetosomów i dlatego produkcja magnetosomów nie ma znaczącego wpływu na stężenie cytrynianu żelaza w pożywce hodowlanej. Jajan i in. , wykazały, że siarczan żelaza był lepszym źródłem żelaza niż chinian żelaza i cytrynian żelaza dla M. gryphiswaldense . W badaniu AMB-1, Yang et al. , używali różnych siarczanów żelazowych i chelatów żelazowych jako źródeł żelaza i porównywali ich działanie. Produkcja magnetosomów została znacznie zwiększona przez galusan żelaza i siarczan, a także wpływ na inne źródło żelaza (chinian żelaza, jabłczan żelaza) i szybkość wchłaniania żelaza.

jon żelaza (Fe3+) jest pobierany podczas dynamicznego wzrostu komórki, a pobierana ilość jest skorelowana z tworzeniem magnetosomów, gdy rozpuszczony poziom tlenu w pożywce jest niewykrywalny. Tworzenie magnetosomów wymaga mikromolowego stężenia żelaza i warunków mikrooksycznych . Komórki MSR – 1 są niemagnetyczne w warunkach tlenowych, ale zaczynają wytwarzać magnetyt, gdy stężenie rozpuszczonego tlenu spadnie poniżej wartości progowej (20 mbar lub niewykrywalne). W fazie loga wzrostu komórki jon żelazowy jest pobierany szybko, a jego szybkość wchłaniania wynosi > 80% i jest skorelowana z tworzeniem magnetosomów .

synteza Magnetosomów zużywa ATP

ATP jest uniwersalnym źródłem energii wymaganym do metabolizmu, transportu molekularnego, transdukcji sygnału i innych kluczowych procesów fizjologicznych komórek. Synteza magnetosomów wymaga dużej ilości energii, A Pobór żelaza zależy od dostępności ATP. NADH zapewnia gradient protonu przez wewnętrzną błonę mitochondrialną do produkcji ATP katalizowanej przez syntazę ATP . Stosunek NADH / NAD+ gwałtownie wzrasta po dojrzewaniu magnetosomu podczas fazy log.

Moc redukująca znacznie wzrasta podczas syntezy magnetosomów; jednak nadmierna moc redukująca może hamować syntezę magnetosomów i wzrost komórek . MSR-1 może zużywać nadmierną moc redukującą poprzez syntezę polihydroksymaślanu (PHB) i uwalnianie wodoru . Komórki MSR-1 zawierają granulki PHB . Nokaut genu syntazy PHB w MSR-1 spowodował wzrost liczby magnetosomów o ~ 30%. W ten sposób dochodzi do konkurencji energetycznej pomiędzy PHB a procesem syntezy magnetosomów. Mutant genu ATPazy MSR i MSR-NPHB wytworzony przez koniugację został użyty jako narzędzie inżynierii genetycznej do wykazania, że promotor acetylotransferazy chloramfenikolowej (CAT) zwiększa ekspresję genu ATPazy w dalszym ciągu. W porównaniu z MSR-1 MSR-NPHB wykazywał 35% większą aktywność hydrolizy, 71% mniejszą akumulację PHB, 56% większe zużycie tlenu i 40% większe zużycie mleczanów. Maksymalna wydajność MSR-NPHB w bioreaktorze 7,5 L wynosiła 58,4 ± 6,4 mg L-1 . Wyniki te pokazują, że wydajność magnetosomów może być zwiększona, a koszty produkcji i czas zredukowany, poprzez manipulację genetyczną MSR – 1 w połączeniu z optymalizacją/ modyfikacją Kultury i podłoża wzrostu.

aktywność dysmutazy ponadtlenkowej

synteza Magnetosomów jest związana z rozpadem H2O2 in vitro i z działaniem ochronnym przed toksycznością H2O2 w komórkach. W mikroorganizmach enzymatyczna dysmutaza ponadtlenkowa rozkłada H2O2 i anionorodnik ponadtlenkowy (O2−), które mają destrukcyjny wpływ na makrocząsteczki komórkowe . W bakteriach magnetotaktycznych dysmutaza ponadtlenkowa zmniejsza również stres oksydacyjny podczas tworzenia magnetosomów. H2O2 może tworzyć Rodnik hydroksylowy po otrzymaniu elektronu z żelaza żelaznego (Fe2+). Rodnik hydroksylowy jest reaktywnym tlenem (ROS), który może uszkodzić biomolekuły . Yang et al. , wykazano, że gdy w późnej fazie log jest dostępna wystarczająca ilość rozpuszczonego tlenu i składników odżywczych, tworzenie i dojrzewanie magnetosomów nie jest w stanie dogonić szybkości podziału komórek, co prowadzi do rozcieńczenia magnetosomów. Zmniejszenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej może więc wynikać z podobieństwa rozcieńczonego ROS. Magnetosomy, a także sztuczne nanocząstki magnetyczne, uczestniczą w usuwaniu ROS, a aktywność ta może również prowadzić do zmniejszonej aktywności dysmutazy ponadtlenkowej.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.