evenwichtige voeding met nutriënten

de belangrijkste factor die de groei van magnetotactische bacteriën en bijgevolg de vorming van magnetosomen beïnvloedt, is de concentratie van nutriënten, met name koolstofbron. Het was niet mogelijk om geoptimaliseerde medium voorwaarden bepaald voor MSR-1 groei in schudkolf cultuur direct uit te breiden naar massaproductie schaal fermentor cultuur . Tijdens de MSR-1-cultuur heeft accumulatie van overmatige voedingsstoffen en remmende componenten in medium snelheidsbeperkende effecten op de celgroei. Volgens Liebig ‘ s Wet van het Minimum wordt biomassa in een bepaald systeem doorgaans beperkt door de hoeveelheid van een bepaalde nutriënt, zelfs wanneer andere nutriënten overmatig aanwezig zijn .

een voedingsstoffengebalanceerde voedingsstrategie kan het remmende effect van een overmatige hoeveelheid voedingsstoffen in het medium verminderen. In deze strategie wordt de accumulatie van Na+ en Cl− ionen verminderd door vervanging van koolstof-en stikstofbronnen. In fed-batch cultuur vermindert de accumulatie van Na+ en Cl− ionen het osmotische potentieel en remt bijgevolg de celgroei. Zelfs een lage NaCl concentratie (40 mM ) remde de celgroei . Een uitgebalanceerde voedingsstrategie kan de groei dus aanzienlijk verbeteren.

Liu et al. , een “chemostat cultuur” techniek voor MSR-1 teelt gebaseerd op Ph-stat voeding om consistentie van stikstof, koolstof en ijzer concentraties te handhaven met behulp van verschillende organische zuren. Microaerobe omstandigheden werden toegepast voor MSR-1 teelt in een fed-batch autofermentor systeem. Voor PH-stat-voeding werd een voedingsoplossing gebruikt die (per liter) ijzercitraat (4,2 g), melkzuur (52,6 g), natriumlactaat (129 g) en NH4Cl (54,9 g) bevat. Hoge waarden van magnetosoomopbrengst (83,23 ± 5,36 mg L− 1) en celgroei (55,49 mg L− 1 dag− 1) werden bereikt bij een laag natriumlactaatgehalte (Tabel 1). De techniek van de chemostatcultuur bevordert efficiënt magnetosoomopbrengst en celgroei met lage tijd en energiekosten. Cytotoxische effecten werden waargenomen voor overmatige concentratie opgeloste zuurstof (≥ 20 ppb) en de aanwezigheid van melkzuur in het medium. Kunstmatige controlestrategieën voor autofermentorsystemen moeten worden aangepast aan de fysiologische toestand van cellen. Ook Fernández-Castané et al. , demonstreerde de pH-stat fed-batch groeistrategie. In deze strategie werden verschillende concentraties melkzuur (koolstofbron) en natriumnitraat (elektronenacceptor) in het voer toegepast. De groeivoorwaarden en de intracellulaire ijzerconcentratie werden geoptimaliseerd volgens de biomassaconcentratie. De hoogste biomassaconcentratie bereikte OD565 nm = 15,50 .

Tabel 1 opbrengst productie van magnetosomen door magnetotaïsche bacteriën en hun voorwaarden

MSR – 1 celgroei en magnetosoomvorming zijn hoog wanneer natriumlactaat als koolstofbron wordt gebruikt. Anderzijds, is de lage concentratie van het natriumlactaat nodig om lage concentratie opgeloste zuurstof voor snelle celgroei en magnetosoomvorming te handhaven . Het handhaven van de natriumlactaatconcentratie in massaproductie scale-up is moeilijk, en Specifieke voedingsstrategieën zijn daarom vereist in het laboratorium. NH4Cl blijkt een betere stikstofbron te zijn dan NaNO3 .

Zhang et al. , bereikte maximale magnetosoomopbrengst in MSR-1 gebruikend een semi-continue cultuurstrategie. Geoptimaliseerde kolfmedium werd gebruikt in 7,5 – en 42-L autofermentoren, nutriënt-evenwichtige voeding strategie werd toegepast, en koolstof en stikstof bronnen werden vervangen om de accumulatie van Na+ en Cl− ionen te verminderen. Het osmotische potentieel werd verminderd door accumulatie van Na+ en Cl− ionen, waardoor de magnetosoomopbrengst en celgroei werden geremd. We bereikten maximale waarden in fed-batch cultuur van magnetosoom opbrengst 356.52 mg L – 1 en celgroei 9,16 g L− 1 (Tabel 1).

Yang et al. , gekweekte AMB – 1 cellen in magnetische spirillum groeimedium (MSGM) verrijkt met L-cysteïne, gistextract, en polypeptone. In dit systeem verbeterde L-cysteïne de celgroei en verminderde de vertragingsfase, resulterend in hoge magnetosoomproductie. De toevoeging van slechts gistextract en polypeptone resulteert in lichtjes productie van magnetosomen. Gistextract vertoont geen significant effect in magnetosoomproductie, terwijl polypeptone alleen de uiteindelijke celdichtheid verhoogt . De reden voor een verbeterde productie van magnetosomen door L-cysteïne is onbekend, maar aangenomen wordt dat de productie van magnetosomen niet geassocieerd is met een lager redoxpotentieel in aanwezigheid van L-cysteïne . Bovendien kan AMB-1 groeien zonder beschikbare aminozuren en de l-cysteine synthese routes in AMB-1 kunnen niet efficiënt zijn of gerelateerd aan celgroei. Daarom kan AMB-1 direct L-cysteïne gebruiken in plaats van het te moeten synthetiseren voor het vergemakkelijken van de celgroei .

Ke et al. , gekweekte Magnetospirillum sp. ME – 1 in groeimedium verrijkt met natriumacetaat, natriumsuccinaat, gistextract, MgSO4, NH4Cl en ijzercitraat. ME-1 gebruikt koolstofbron voor de groei zoals succinaat, fumaraat, oxaloacetaat, pyruvaat, acetaat, lactaat, malaat en pepton. Bovendien kan ME-1 groeien in afwezigheid van stikstofbron, echter, NH4Cl of NaNO3 suppletie verbeteren de ME-1 groei. ME-1 stelt urease en oxidase activiteit tentoon, die het vermogen van aërobe groei suggereren, echter, aërobe voorwaarde remt de magnetosoomvorming in ME-1 . Fed-batch fermentatie van ME-1 werd geoptimaliseerd op een constant niveau van pH 6,8 in een 10-L vergister op basis van pH-statische voeding, terwijl het leveren van de koolstof, stikstof en ijzer bronnen voor grootschalige productie (Tabel 1).

ondanks de hoge opbrengst van magnetosomen bevatten dergelijke ontwikkelde methoden voor de groei van magnetotactische bacteriën toxische componenten in groeimedium. Deze componenten omvatten kankerverwekkende, mutagene en reprotoxische chemicaliën, zware metalen, chelaatvormers en niet gekarakteriseerde dierlijke afgeleide ingrediënten zoals gistextract . Er is een grote behoefte aan grootschalige productie van pure magnetosomen met de laagst mogelijke hoeveelheid van dergelijke onzuiverheden of toxische componenten (andere metalen dan ijzer) te verkrijgen. Daarom Berny et al. , ontwikkelde een minimaal groeimedium voor magnetosomen productie met minder of verstoken van toxische componenten, en met vergelijkbare magnetosoom eigenschappen als die verkregen in de best gerapporteerde groeiomstandigheden door Zhang et al. . Ten eerste werden magnetotactische bacteriën versterkt in pre-groeimedium zonder magnetosomen te produceren . In de tweede stap werden magnetotactische bacteriën vervolgens gevoed met een ijzerrijk gevoed-batchmedium dat magnetosoomsynthese mogelijk maakte . Na 50 uur groei bereikte de biomassaconcentratie OD565 nm = 8 en leverde de productie van magnetosomen op van ongeveer 10 mg / L groeimedium. Een significante vermindering/verdwijning van de magnetosoomsamenstelling van Zn, Mn, Ba en Al werd waargenomen . Deze nieuwe strategie voor de productie van magnetosomen zonder of de laagste concentratie van onzuiverheden anders dan ijzer, effent de weg naar medische toepassingen.

concentratie opgeloste zuurstof

biosynthese van Magnetosomen vereist microaerobe of anoxische omstandigheden. Het lage niveau van opgeloste zuurstof beà nvloedt de celgroei beduidend omdat de cultuur met hoge dichtheid hoge opgeloste zuurstof vereist om gewenste magnetosoomopbrengst te verkrijgen. Aan de andere kant, kan de verhoogde opgeloste zuurstof de dichtheid van MSR-1 in cultuurmedium verhogen maar de vorming van magnetosomen remmen . Een conflict bestaat aldus tussen magnetosome vorming en celgroei, die het moeilijk maken om gelijktijdig hoge MSR-1 celdichtheid en hoge magnetosome opbrengst te bereiken. Dit conflict kan enigszins worden opgelost door opgeloste zuurstof op een optimaal niveau te regelen door aanpassing van de celgroei. Jajan et al. , meldde de verminderde ijzeropname en magnetosomen productie bij het gehalte aan opgeloste zuurstof van meer dan 5-10 ppm. Echter, wanneer opgeloste zuurstof lager was dan 5-10 ppm, ijzer opname tarief en productie van magnetosomen werd verhoogd, die waarschijnlijk als gevolg van de langzame groei van bacteriën . Sun et al. , gevestigde massacultuur van MSR-1 voor verbeterde magnetosoomproductie in een 42-L fermentor, met geoptimaliseerd kolfmedium, door toepassing van strikte microaerobe omstandigheden (bijna-nul opgeloste zuurstofconcentratie) en gebruik van ijzercitraat en natriumlactaat als ijzer-en koolstofbronnen in medium. Deze strategie was efficiënt voor opbrengstteelt van magnetosomes omdat de celgroei bij lage opgeloste zuurstofconcentratie werd geregeld, resulterend in hoge magnetosome opbrengst.

AMB-1 is een facultatieve anaërobe magnetotactische bacterie die elektronen overbrengt via twee ademhalingswegen. Onder aërobe de groeivoorwaarden, gebruikt AMB-1 zuurstof als elektronenacceptor en bevordert noch remt vorming van magnetische deeltjes. In een alternatieve weg, gebruikt AMB-1 nitraat als elektronenacceptor en vereist daarom lage Media redoxpotentialen, die tot magnetosome vorming bevorderlijk zijn. In een studie van Yang et al. , magnetosoom productie tarief was hoog onder lage concentratie opgeloste zuurstof in vloeibare fase. Wanneer de concentratie opgeloste zuurstof in vloeibare fase een bepaald niveau overschreed (0.20 ppm), de respiratoire weg verschoven naar aërobe groei, wat leidt tot verminderde magnetosoom productie.

de concentratie opgeloste zuurstof wordt sterk beïnvloed door de luchtstroom en de roersnelheid. Wanneer opgeloste zuurstof tijdens de eerste groeifase wordt verhoogd door het verhogen van de luchtstroom en het roeren van tarieven, blijft de magnetosoomopbrengst laag totdat opgeloste zuurstof daalt tot een niet-detecteerbaar niveau. Om dit fenomeen in MSR-1-teelt te overwinnen, moet opgeloste zuurstof worden verbeterd tot een optimaal niveau door te roeren, en cellen moeten dan toegestaan om opgeloste zuurstof door ademhaling te verminderen, totdat het niveau optimaal voor magnetosoomvorming wordt bereikt. Hoge magnetosoomproductie werd bereikt door het optimaliseren / aanpassen van de luchtstroom en roersnelheden . Tijdens de eerste kweekfase werd de opgeloste zuurstof verminderd door deze snelheden respectievelijk op 1 L min− 1 en 200 rpm min− 1 te handhaven. Tijdens latere cultuurfase, werd opgeloste zuurstof verhoogd door het aanpassen van de luchtstroom tot 2 L min-1 bij 20 h en roeren snelheid tot 300 rpm min-1 bij 28 h. onder deze omstandigheden, cellen snel gegroeid, opgeloste zuurstof niet detecteerbaar bij 12 h, en celdichtheid bereikt OD565 nm = 12.3 bij 36 h. natriumlactaat en ijzercitraat concentraties werden gecontroleerd respectievelijk in het bereik 3-6 mmol L-1 en 70-110 µmol L-1 tijdens het proces. Zo werden hoge waarden van het magnetosoomrendement (83,23 ± 5,36 mg L− 1) en de productiviteit (55,49 mg L− 1 dag− 1) bereikt (Tabel 1).

in de ME-1-teelt werd opgeloste zuurstof gecontroleerd om de magnetosoomproductie op een constant niveau van 0,5% te verhogen door koppeling aan de luchtstroom en de roersnelheid. Tijdens fed-batch fermentatie, een roersnelheid (in het bereik van 50-300 rpm) produceerde een grote hoeveelheid magnetosomen bij constant niveau van opgeloste zuurstof (0,5%). De resulterende celdichtheid en magnetosoomopbrengst bij 49 uur waren 6,5 (OD565) en 120 mg L− 1 (vers gewicht). Deze strategie bereikte hoge magnetosome opbrengst en productiviteit, dus wijzen erop dat ME-1 groot potentieel voor de grootschalige productie van magnetosomes heeft .

lage gehalten aan opgeloste zuurstof zijn empirisch vastgesteld in vele studies, maar zonder continue meting van de concentratie opgeloste zuurstof of definitie van de controle ervan in het medium. Heyen en Schüler , een methode voor automatische controle van lage zuurstofspanning (pO2) in MSR-1 kweekmedium met behulp van een fermentor systeem voor oxystat werking. pO2 spanning werd gecorreleerd met magnetietvorming. De laagste geregistreerde pO2-waarde (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) was het meest gunstig voor magnetosoomvorming. Cellen die onder oxystatomstandigheden werden gekweekt, vertoonden een significant hogere magnetietopbrengst (6,3 mg L− 1 dag− 1) (Tabel 1).

opname van ijzerionen

ijzer is vereist als cofactor voor vele enzymen, met name die welke betrokken zijn bij belangrijke biologische routes. Specifieke ijzertransportmechanismen in cellen zorgen voor ijzerniveaus die voldoende zijn voor een optimale groei. Sommige bacteriën produceren ijzerchelatoren (genoemd siderophores) om ijzer (Fe3+) op te nemen. Magnetotactische bacteriën synthetiseren magnetosomen samengesteld uit magnetiet of greigiet na het vinden van microaerofiele omstandigheden geschikt voor hun groei . In MSR-1 is magnetiet de belangrijkste component van magnetosomen en wordt de magnetosoomproductie daarom niet significant beïnvloed door de concentratie ijzercitraat in kweekmedium. Jajan et al. , toonde aan dat ferrosulfaat een betere bron van ijzer was dan ijzerquinaat en ijzercitraat voor M. gryphiswaldense . In een studie van AMB-1, Yang et al. , gebruikte diverse ijzersulfaat en ijzerchelaten als ijzerbronnen, en vergeleek hun effecten. De magnetosoomproductie werd significant versterkt door ferrig gallaat en sulfaat, en werd ook beïnvloed door andere ijzerbronnen (ferriquinaat, ferrimalaat) en door de ijzeropname.

ijzer-ion (Fe3+) wordt opgenomen tijdens de dynamische celgroei en de opgenomen hoeveelheid is gecorreleerd met de vorming van magnetosomen wanneer het gehalte aan opgeloste zuurstof in het medium niet detecteerbaar is. Magnetosoomvorming vereist micromolaire ijzerconcentratie en microoxische omstandigheden . MSR – 1 cellen zijn niet-magnetisch onder oxische omstandigheden, maar beginnen magnetiet te produceren wanneer de concentratie opgeloste zuurstof onder een drempelwaarde daalt (20 mbar of niet-detecteerbaar). In de log-fase van de celgroei wordt ijzerion snel opgenomen en is de absorptiesnelheid > 80% en gecorreleerd met de vorming van magnetosomen .

Magnetosoomsynthese verbruikt ATP

ATP is de universele energiebron die nodig is voor metabolisme, moleculair transport, signaaltransductie en andere cruciale celfysiologische processen. Magnetosoomsynthese vereist een grote hoeveelheid energie, en ijzeropname hangt van ATP beschikbaarheid af. NADH verstrekt een protongradiënt over het binnen mitochondrial membraan voor ATP productie gekatalyseerd door ATP synthase . NADH / NAD+ – ratio neemt snel toe na magnetosoomrijping tijdens de logfase.

reducerend vermogen neemt significant toe tijdens de magnetosoomsynthese; overmatig reducerend vermogen kan echter de magnetosoomsynthese en celgroei remmen . MSR-1 kan overmatig reducerend vermogen verbruiken door polyhydroxybutyraat (PHB) synthese en waterstofversie . MSR – 1-cellen bevatten PHB-korrels . Knockout van PHB synthase gen in MSR-1 resulteerde in ~ 30% verhoging van magnetosoom aantal . Energieconcurrentie treedt dus op tussen PHB en het magnetosoomsyntheseproces. Een mutant van ATPase gen van MSR en MSR-NPHB die door conjugatie wordt gecreeerd werd gebruikt als gentechniek hulpmiddel om aan te tonen dat de promotor van chloramphenicol acetyltransferase (CAT) stroomafwaarts uitdrukking van ATPase gen verhoogt. In vergelijking met MSR-1 vertoonde MSR-NPHB een 35% hogere hydrolyseactiviteit, 71% lagere PHB-accumulatie, 56% hoger zuurstofverbruik en 40% hoger lactaatverbruik. De maximale opbrengst van MSR-NPHB in een 7,5-L bioreactor was 58,4 ± 6,4 mg L-1 . Deze bevindingen tonen aan dat de magnetosoomopbrengst kan worden verbeterd, en de productiekosten en de tijd kunnen worden verminderd, door genetische manipulatie van MSR-1 in combinatie met optimalisatie/ modificatie van cultuur-en groeimedia.

superoxide dismutase activiteit

Magnetosoomsynthese wordt geassocieerd met in vitro afbraak van H2O2 en met beschermende effecten tegen H2O2 toxiciteit in cellen. In micro− organismen breekt het enzym superoxide dismutase H2O2 en superoxide anion radical (O2−) af, die beide destructieve effecten hebben op celmacromoleculen . In magnetotactische bacteriën vermindert superoxide dismutase ook oxidatieve stress tijdens magnetosoomvorming. H2O2 kan een hydroxylradicaal vormen na ontvangst van een elektron uit ijzer (Fe2+). Hydroxylradicaal is de reactieve zuurstofsoort (ROS) die biomoleculen kan beschadigen . Yang et al. , aangetoond dat wanneer voldoende opgeloste zuurstof en voedingsstoffen beschikbaar zijn in de late logfase, magnetosoomvorming en rijping niet in staat zijn om de snelheid van de celdeling in te halen, wat leidt tot verdunning van magnetosomen. De vermindering van de activiteit van superoxide dismutase kan dus het gevolg zijn van de gelijkenis van verdund ROS. Magnetosomes, evenals kunstmatige magnetische nanoparticles, nemen in het opruimen van ROS deel, en deze activiteit kan ook tot verminderde superoxide dismutase activiteit leiden.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.