Alimentación equilibrada de nutrientes

El principal factor que afecta el crecimiento de las bacterias magnetotácticas y, en consecuencia, la formación de magnetosomas, es la concentración de nutrientes, en particular la fuente de carbono. No fue posible extender las condiciones optimizadas del medio determinadas para el crecimiento de MSR-1 en cultivo de matraz agitado directamente al cultivo fermentador a escala de producción en masa . Durante el cultivo de MSR – 1, la acumulación de nutrientes excesivos y componentes inhibitorios en el medio ejerce efectos limitadores de velocidad en el crecimiento celular. De acuerdo con la Ley del Mínimo de Liebig, la biomasa en un sistema determinado suele estar restringida por la cantidad de un nutriente en particular, incluso cuando otros nutrientes están presentes en exceso .

Una estrategia de alimentación equilibrada en nutrientes puede reducir el efecto inhibitorio de una cantidad excesiva de nutrientes en el medio. En esta estrategia, la acumulación de iones Na+ y Cl− se reduce mediante el reemplazo de fuentes de carbono y nitrógeno. En cultivos por lotes alimentados, la acumulación de iones Na+ y Cl disminuye el potencial osmótico y, en consecuencia, inhibe el crecimiento celular. Incluso una baja concentración de NaCl (40 mm ) inhibió el crecimiento celular . Por lo tanto, una estrategia de alimentación equilibrada en nutrientes puede mejorar significativamente la tasa de crecimiento.

Liu et al. , estableció una técnica de «cultivo de quimiostatos» para el cultivo de MSR-1 basada en la alimentación de estadísticas de pH para mantener la consistencia de las concentraciones de nitrógeno, carbono y hierro utilizando varios ácidos orgánicos. Se aplicaron condiciones microaeróbicas para el cultivo de MSR-1 en un sistema de autofermentor por lotes alimentados. Se utilizó una solución nutritiva que contenía (por litro) citrato férrico (4,2 g), ácido láctico (52,6 g), lactato de sodio (129 g) y NH4Cl (54,9 g) para la alimentación de pH-stat. Se alcanzaron valores altos de rendimiento de magnetosoma (83,23 ± 5,36 mg L− 1) y crecimiento celular (55,49 mg L− 1 día− 1) a niveles bajos de lactato de sodio (Tabla 1). La técnica de cultivo de quimiostatos promueve de manera eficiente el rendimiento del magnetosoma y el crecimiento celular con un bajo costo de tiempo y energía. Se observaron efectos citotóxicos en concentraciones excesivas de oxígeno disuelto (≥ 20 ppb) y presencia de ácido láctico en el medio. Las estrategias de control artificial de los sistemas de autofermentor deben ajustarse en función del estado fisiológico de las células. De manera similar, Fernández-Castané et al. , demostró la estrategia de crecimiento de lotes alimentados con estadísticas de pH. En esta estrategia se aplicaron varias concentraciones de ácido láctico (fuente de carbono) y nitrato de sodio (aceptor de electrones) en la alimentación. Las condiciones de crecimiento y la concentración de hierro intracelular se optimizaron de acuerdo con la concentración de biomasa. La concentración de biomasa más alta alcanzó OD565 nm = 15,50 .

Tabla 1 Producción de magnetosomas por bacterias magnetotaicas y sus condiciones

El crecimiento celular de MSR-1 y la formación de magnetosomas son altos cuando se usa lactato de sodio como fuente de carbono. Por otro lado, se necesita una baja concentración de lactato de sodio para mantener una baja concentración de oxígeno disuelto para un rápido crecimiento celular y la formación de magnetosomas . Mantener la concentración de lactato de sodio en la ampliación de la producción en masa es difícil, por lo que se requieren estrategias de alimentación específicas en el laboratorio. Se ha demostrado que el NH4Cl es una mejor fuente de nitrógeno que el NaNO3 .

Zhang et al. , alcanzó el rendimiento máximo del magnetosoma en MSR-1 utilizando una estrategia de cultivo semicontinuo. Se utilizó medio de matraz optimizado en autofermentores de 7,5 y 42 litros, se aplicó una estrategia de alimentación equilibrada de nutrientes y se reemplazaron fuentes de carbono y nitrógeno para reducir la acumulación de iones Na+ y Cl. El potencial osmótico se redujo por la acumulación de Na + y Cl− ion, inhibiendo así el rendimiento del magnetosoma y el crecimiento celular. Alcanzamos valores máximos en cultivo por lotes de magnetosoma de rendimiento 356.52 mg L− 1 y crecimiento celular 9,16 g L− 1 (Tabla 1).

Yang et al. , células AMB-1 cultivadas en medio de crecimiento de espirillum magnético (MSGM) enriquecido con L-cisteína, extracto de levadura y polipeptona. En este sistema, la L-cisteína mejora el crecimiento celular y reduce la fase de retraso, lo que resulta en una alta producción de magnetosomas. La adición de solo extracto de levadura y polipeptona da como resultado una ligera producción de magnetosomas. El extracto de levadura no muestra un efecto significativo en la producción de magnetosomas, mientras que el polipeptón solo aumenta la densidad celular final . Se desconoce la razón para mejorar la producción de magnetosomas por L-cisteína, sin embargo, se asume que la producción de magnetosomas no está asociada con potenciales redox más bajos en presencia de L-cisteína . Además, el AMB-1 puede crecer sin aminoácidos disponibles y las vías de síntesis de L-cisteína en el AMB-1 pueden no ser eficientes o estar relacionadas con el crecimiento celular. Por lo tanto, el AMB-1 puede usar directamente L-cisteína en lugar de tener que sintetizarla para facilitar el crecimiento celular .

Ke et al. , Magnetospirillum sp cultivado. ME-1 en medio de crecimiento enriquecido con acetato de sodio, succinato de sodio, extracto de levadura, MgSO4, NH4Cl y citrato férrico. ME-1 utiliza una fuente de carbono para el crecimiento, como succinato, fumarato, oxaloacetato, piruvato, acetato, lactato, malato y peptona. Además, el ME-1 puede crecer en ausencia de una fuente de nitrógeno, sin embargo, la suplementación con NH4Cl o NaNO3 mejora el crecimiento del ME-1. El ME-1 exhibe actividad de ureasa y oxidasa, lo que sugiere la capacidad de crecimiento aeróbico, sin embargo, la condición aeróbica inhibe la formación de magnetosomas en el ME-1 . Se optimizó la fermentación de ME-1 en lotes alimentados a un nivel constante de pH 6,8 en un fermentador de 10 L basado en alimentación estática de pH, al tiempo que suministraba las fuentes de carbono, nitrógeno y hierro para la producción a gran escala (Tabla 1).

A pesar del alto rendimiento de los magnetosomas, estos métodos desarrollados para el crecimiento de bacterias magnetotácticas contienen componentes tóxicos en el medio de crecimiento. Estos componentes incluyen productos químicos cancerígenos, mutágenos y tóxicos para la reproducción, metales pesados, agentes quelantes e ingredientes de origen animal no caracterizados, como el extracto de levadura . Existe una gran necesidad de obtener una producción a gran escala de magnetosomas puros con la menor cantidad posible de tales impurezas o componentes tóxicos (otros metales que el hierro). Por lo tanto, Berny et al. , desarrolló un medio de crecimiento mínimo para la producción de magnetosomas con menos o sin componentes tóxicos, y con propiedades magnetosómicas similares a las obtenidas en las mejores condiciones de crecimiento reportadas por Zhang et al. . En primer lugar, las bacterias magnetotácticas se amplificaron en un medio previo al crecimiento sin producir magnetosomas . En el segundo paso, las bacterias magnetotácticas se alimentaron con un medio de alimentación rico en hierro que contenía para permitir la síntesis de magnetosomas . Después de 50 h de crecimiento, la concentración de biomasa alcanzó OD565 nm = 8 y produce una producción de magnetosomas de aproximadamente 10 mg / L de medio de crecimiento. Se observó una reducción/desaparición significativa en la composición de magnetosomas de Zn, Mn, Ba y Al . Esta nueva estrategia para la producción de magnetosomas sin o con la menor concentración de impurezas distintas del hierro, allana el camino hacia aplicaciones médicas.

Concentración de oxígeno disuelto

La biosíntesis de magnetosomas requiere condiciones microaeróbicas o anóxicas. El bajo nivel de oxígeno disuelto afecta significativamente el crecimiento celular porque el cultivo de alta densidad requiere un alto nivel de oxígeno disuelto para obtener el rendimiento deseado del magnetosoma. Por otro lado, el aumento del oxígeno disuelto puede aumentar la densidad de MSR-1 en el medio de cultivo, pero inhibir la formación de magnetosomas . Por lo tanto, existe un conflicto entre la formación de magnetosomas y el crecimiento celular, lo que dificulta lograr simultáneamente una alta densidad celular MSR-1 y un alto rendimiento de magnetosomas. Este conflicto puede resolverse de alguna manera controlando el oxígeno disuelto a un nivel óptimo a través del ajuste de la tasa de crecimiento celular. Jajan et al. , informó de la reducción de la absorción de hierro y la producción de magnetosomas a un nivel de oxígeno disuelto superior a 5-10 ppm. Sin embargo, cuando el oxígeno disuelto era inferior a 5-10 ppm, la tasa de absorción de hierro y la producción de magnetosomas aumentaban, lo que probablemente se debía al lento crecimiento de las bacterias . Sun et al. , cultivo masivo establecido de MSR-1 para una mayor producción de magnetosomas en un fermentador de 42 L, con medio de matraz optimizado, mediante la aplicación de condiciones microaeróbicas estrictas (concentración de oxígeno disuelto cercana a cero) y el uso de citrato férrico y lactato de sodio como fuentes de hierro y carbono en medio. Esta estrategia fue efectiva para el cultivo de rendimiento de magnetosomas porque el crecimiento celular se reguló a baja concentración de oxígeno disuelto, lo que resultó en un alto rendimiento de magnetosomas.

AMB-1 es una bacteria magnetotáctica anaeróbica facultativa que transfiere electrones a través de dos vías respiratorias. En condiciones de crecimiento aeróbico, el AMB-1 utiliza oxígeno como aceptor de electrones y no promueve ni inhibe la formación de partículas magnéticas. En una vía alternativa, el AMB-1 utiliza nitrato como aceptor de electrones y, por lo tanto, requiere potenciales redox de medios bajos, que son propicios para la formación de magnetosomas. En un estudio de Yang et al. , la tasa de producción de magnetosomas fue alta bajo baja concentración de oxígeno disuelto en fase líquida. Cuando la concentración de oxígeno disuelto en fase líquida excede un cierto nivel (0.20 ppm), la vía respiratoria se desplazó hacia el crecimiento aeróbico, lo que llevó a una reducción de la producción de magnetosomas.

La concentración de oxígeno disuelto se ve fuertemente afectada por el caudal de aire y la velocidad de agitación. Cuando el oxígeno disuelto durante la fase de crecimiento inicial se eleva aumentando el flujo de aire y las velocidades de agitación, el rendimiento del magnetosoma permanece bajo hasta que el oxígeno disuelto disminuye a un nivel indetectable. Para superar este fenómeno en el cultivo de MSR-1, se debe aumentar el oxígeno disuelto a un nivel óptimo mediante agitación, y luego se debe permitir que las células reduzcan el oxígeno disuelto a través de la respiración, hasta alcanzar el nivel óptimo para la formación de magnetosomas. Se logró una alta producción de magnetosomas optimizando / ajustando el flujo de aire y las velocidades de agitación . Durante la fase de cultivo inicial, el oxígeno disuelto se redujo manteniendo estas tasas respectivamente a 1 L min-1 y 200 rpm min-1. Durante la fase de cultivo posterior, se aumentó el oxígeno disuelto ajustando la velocidad de flujo de aire a 2 L min-1 a 20 h y la velocidad de agitación a 300 rpm min-1 a 28 h. En estas condiciones, las células crecieron rápidamente, el oxígeno disuelto se volvió indetectable a 12 h y la densidad celular alcanzó OD565 nm = 12,3 a 36 h. Las concentraciones de lactato de sodio y citrato férrico se controlaron respectivamente en los rangos de 3-6 mmol L− 1 y 70-110 µmol L− 1 durante el proceso. De este modo, se alcanzaron altos valores de rendimiento magnetosómico (83,23 ± 5,36 mg L− 1) y productividad (55,49 mg L− 1 día− 1) (Tabla 1).

En el cultivo de ME-1, se controló el oxígeno disuelto para mejorar la producción de magnetosomas a un nivel constante de 0,5% mediante el acoplamiento a la velocidad de flujo de aire y la velocidad de agitación. Durante la fermentación por lotes alimentados, una velocidad de agitación (en el rango de 50-300 rpm) produjo una gran cantidad de magnetosomas a un nivel constante de oxígeno disuelto (0,5%). La densidad celular resultante y el rendimiento del magnetosoma a las 49 h fueron de 6,5 (OD565) y 120 mg L− 1 (peso húmedo). Esta estrategia logró un alto rendimiento y productividad de magnetosomas, lo que indica que el ME-1 tiene un gran potencial para la producción a gran escala de magnetosomas .

Los niveles bajos de oxígeno disuelto se han establecido empíricamente en muchos estudios, pero sin la medición continua de la concentración de oxígeno disuelto o la definición de su control en el medio. Heyen y Schüler establecieron un método para el control automático de baja tensión de oxígeno (pO2) en medio de cultivo MSR-1 utilizando un sistema fermentador para el funcionamiento de oxystat. La tensión de pO2 se correlacionó con la formación de magnetita. El valor de pO2 más bajo registrado (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) fue el más favorable para la formación de magnetosomas. Las células cultivadas en condiciones de oxistato mostraron un rendimiento de magnetita significativamente mayor (6,3 mg L− 1 día− 1) (Tabla 1).

Absorción de iones férricos

El hierro es necesario como cofactor para muchas enzimas, en particular las que participan en las principales vías biológicas. Los mecanismos específicos de transporte de hierro en las células proporcionan niveles de hierro suficientes para un crecimiento óptimo. Algunas bacterias producen quelantes férricos (denominados sideróforos) para absorber el hierro férrico (Fe3+). Las bacterias magnetotácticas sintetizan magnetosomas compuestos de magnetita o greigita después de encontrar condiciones microaerofílicas adecuadas para su crecimiento . En MSR-1, la magnetita es el componente principal de los magnetosomas, y por lo tanto la producción de magnetosomas no se ve afectada significativamente por la concentración de citrato férrico en el medio de cultivo. Jajan et al. , mostró que el sulfato ferroso era una mejor fuente de hierro que el quinato férrico y el citrato férrico para M. gryphiswaldense . En un estudio de AMB-1, Yang et al. , utilizó varios quelatos férricos y de sulfato ferroso como fuentes de hierro, y comparó sus efectos. La producción de magnetosomas aumentó significativamente con galato férrico y sulfato, y también se vio afectada por otras fuentes de hierro (quinato férrico, malato férrico) y por la tasa de absorción de hierro.

El ion férrico (Fe3+) se absorbe durante el crecimiento dinámico de las células, y la cantidad absorbida se correlaciona con la formación de magnetosomas cuando el nivel de oxígeno disuelto en el medio es indetectable. La formación de magnetosomas requiere concentración de hierro micromolar y condiciones microóxicas . Las células MSR-1 no son magnéticas en condiciones de oxígeno, pero comienzan a producir magnetita cuando la concentración de oxígeno disuelto cae por debajo de un valor umbral (20 mbar o indetectable). En la fase logarítmica de crecimiento celular, el ion férrico se absorbe rápidamente, y su tasa de absorción es > 80% y se correlaciona con la formación de magnetosomas .

La síntesis de magnetosomas consume ATP

El ATP es la fuente de energía universal requerida para el metabolismo, el transporte molecular, la transducción de señales y otros procesos fisiológicos celulares cruciales. La síntesis de magnetosomas requiere una gran cantidad de energía, y la absorción de hierro depende de la disponibilidad de ATP. NADH proporciona un gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna para la producción de ATP catalizada por la ATP sintasa . La relación NADH/NAD + aumenta rápidamente después de la maduración del magnetosoma durante la fase logarítmica.

La potencia reductora aumenta significativamente durante la síntesis de magnetosomas; sin embargo, la potencia reductora excesiva puede inhibir la síntesis de magnetosomas y el crecimiento celular . El MSR-1 puede consumir una potencia reductora excesiva a través de la síntesis de polihidroxibutirato (PHB) y la liberación de hidrógeno . Las células MSR-1 contienen gránulos de PHB . La eliminación del gen de la PHB sintasa en MSR-1 produjo un aumento de ~ 30% del número de magnetosomas . Por lo tanto, la competencia energética ocurre entre el PHB y el proceso de síntesis de magnetosomas. Un mutante del gen de la ATPasa de MSR y MSR-NPHB creado por conjugación se utilizó como herramienta de ingeniería genética para demostrar que el promotor de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) aumenta la expresión aguas abajo del gen de la ATPasa. En comparación con el MSR-1, el MSR-NPHB mostró una actividad de hidrólisis 35% mayor, una acumulación de PHB 71% menor, un consumo de oxígeno 56% mayor y un consumo de lactato 40% mayor. El rendimiento máximo de MSR-NPHB en un biorreactor de 7,5 L fue de 58,4 ± 6,4 mg L-1 . Estos hallazgos demuestran que el rendimiento del magnetosoma se puede mejorar, y reducir el costo y el tiempo de producción, a través de la manipulación genética del MSR-1 en combinación con la optimización/ modificación de los medios de cultivo y crecimiento.

La actividad de la superóxido dismutasa

La síntesis de magnetosomas se asocia con la degradación in vitro del H2O2 y con efectos protectores contra la toxicidad del H2O2 en las células. En los microorganismos, la enzima superóxido dismutasa descompone el H2O2 y el radical anión superóxido (O2−), los cuales tienen efectos destructivos sobre las macromoléculas celulares . En las bacterias magnetotácticas, la superóxido dismutasa también reduce el estrés oxidativo durante la formación de magnetosomas. El H2O2 puede formar un radical hidroxilo después de recibir un electrón del hierro ferroso (Fe2+). El radical hidroxilo es la especie reactiva de oxígeno (ROS) que puede dañar las biomoléculas . Yang et al. , demostró que cuando se dispone de suficiente oxígeno disuelto y nutrientes en la fase logarítmica tardía, la formación y maduración de magnetosomas son incapaces de alcanzar la velocidad de división celular, lo que lleva a la dilución de los magnetosomas. Por lo tanto, la reducción de la actividad de la superóxido dismutasa puede resultar de la similitud de las ERO diluidas. Los magnetosomas, así como las nanopartículas magnéticas artificiales , participan en la eliminación de ROS, y esta actividad también puede conducir a una reducción de la actividad de la superóxido dismutasa.

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