栄養バランスのとれた摂食

マグネトタクチック細菌の増殖、ひいてはマグネトソーム形成に影響を与える主な要因は、栄養素、特に炭素源の濃度である。 これは、大量生産規模の発酵槽培養に直接振盪フラスコ培養におけるMSR-1成長のために決定された最適化された培地条件を拡張することはできませ MSR-1培養中に、培地中の過剰な栄養素および阻害成分の蓄積は、細胞増殖に対する律速効果を発揮する。 リービグの最小の法則によれば、所与のシステムにおけるバイオマスは、典型的には、他の栄養素が過剰に存在する場合であっても、ある特定の栄養素の量によって制限される。

栄養バランスのとれた摂食戦略は、培地中の過剰量の栄養素の抑制効果を減らすことができます。 この戦略では、Na+およびCl−イオンの蓄積は、炭素源および窒素源の置換によって減少する。 流加培養では,Na+およびCl−イオンの蓄積は浸透電位を低下させ,その結果,細胞増殖を阻害する。 低NaCl濃度(40mM)でさえ、細胞増殖を阻害した。 従って、栄養釣り合った供給の作戦はかなり成長率を高めることができます。

いくつかの有機酸を用いて窒素、炭素、鉄濃度の一貫性を維持するために、pH-stat給餌に基づくMSR-1培養のための”ケモスタット培養”技術を確立した。 マイクロエアロビック条件は、フェドバッチautofermentorシステムでMSR-1栽培のために適用されました。 (リットル当たり)クエン酸第二鉄(4.2g)、乳酸(52.6g)、乳酸ナトリウム(129g)、およびNh4Cl(54.9g)を含む栄養溶液は、pH-stat給餌のために使用された。 マグネトソーム収率(83.23±5.36mg L−1)と細胞増殖(55.49mg L−1日−1)の高い値は、低乳酸ナトリウムレベルで達成された(表1)。 Chemostat文化技術は効率的に低い時間およびエネルギー-コストのmagnetosomeの収穫そして細胞の成長を促進します。 細胞毒性効果は、過剰な溶存酸素濃度(≧20ppb)と培地中の乳酸の存在のために観察された。 自家発酵システムのための人工的な制御戦略は、細胞の生理学的状態に関して調整されなければならない。 同様に、Fernández-Castané et al. 、pH-stat fed-batch成長戦略を実証した。 この戦略では、乳酸(炭素源)と硝酸ナトリウム(電子受容体)の様々な濃度を飼料に適用した。 バイオマス濃度に応じて増殖条件と細胞内鉄濃度を最適化した。 最も高い生物量の集中はOD565nm=15.50に達しました。

表1磁気細菌によるマグネトソームの産生とその条件

MSR-1細胞の成長とマグネトソーム形成は、乳酸ナトリウムを炭素源として使用すると高い。 一方,急速な細胞増殖とマグネトソーム形成のためには,低溶存酸素濃度を維持するためには低乳酸ナトリウム濃度が必要である。 大量生産のスケールアップの乳酸ナトリウムの集中を維持することは困難であり、従って特定の供給の作戦は実験室で要求されます。 Nh4clはNano3よりよい窒素の源であるために示されていました。

、半連続培養戦略を使用してMSR-1で最大マグネトソーム収率を達成しました。 最適化されたフラスコ培地は、7.5-と42-L autofermentorsで使用された、栄養バランスのとれた給餌戦略が適用され、炭素と窒素源は、Na+とCl-イオンの蓄積を減少させるた 浸透電位はN a+およびCl−イオン蓄積によって減少し,それによってマグネトソーム収量および細胞増殖を阻害した。 我々は、マグネトソーム収率356の流加培養で最大値を達成した。1 6gのL−1(表1)。

Yang et al. 、L-システイン、酵母エキス、およびポリペプトンを濃縮した磁気スピリラム増殖培地(MSGM)中でamb-1細胞を培養した。 この系では,L-システインは細胞増殖を促進し,ラグ相を減少させ,高いマグネトソーム産生をもたらした。 酵母エキスとポリペプトンのみを添加すると、マグネトソームがわずかに生成されます。 酵母抽出物はマグネトソーム産生に有意な効果を示さないが、ポリペプトンは最終的な細胞密度を増加させるだけである。 L-システインによるマグネトソーム産生の改善の理由は不明であるが,マグネトソーム産生はL-システインの存在下での酸化還元電位の低下とは関連していないと考えられている。 さらに、AMB−1は、利用可能なアミノ酸なしで増殖することができ、AMB−1中のL−システイン合成経路は、効率的ではないか、または細胞増殖に関連してい したがって、AMB-1は、細胞増殖を促進するためにそれを合成するのではなく、直接L-システインを使用することができる。

Ke et al. 、培養されたMagnetospirillum sp. 酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酵母抽出物、Mgso4、Nh4Clおよびクエン酸第二鉄で強化された成長培地中のME-1。 ME-1はコハク酸塩、フマル酸塩、oxaloacetate、ピルビン酸塩、アセテート、乳酸塩、リンゴ酸塩およびペプトンのような成長のためにカーボン源を利用します。 さらに、ME-1は窒素源の非存在下で成長することができますが、Nh4ClまたはNano3補給はME-1の成長を強化します。 ME-1はウレアーゼとオキシダーゼ活性を示し、好気性成長の能力を示唆していますが、好気性条件はME-1のマグネトソーム形成を阻害します。 ME-1のフィードバッチ発酵は、ph6.8の一定レベルでpH静的供給に基づいて10L発酵槽で最適化され、大規模生産のための炭素、窒素および鉄源を供給

マグネトソームの収率が高いにもかかわらず、このような開発されたマグネトタクチック細菌の増殖方法は、成長培地中に毒性成分を含む。 これらの成分には、発癌性、変異原性および再毒性化学物質、重金属、キレート剤および酵母抽出物などの非特徴付け動物由来成分が含まれる。 そのような不純物または毒性成分(鉄以外の他の金属)の可能な限り低い量の純粋な磁気圏の大規模な生産を得ることが非常に必要である。 従って、Berny e t a l. さらに、Zhangらによって報告された最良の成長条件で得られたものと同様のマグネトソーム特性を有する、毒性成分の少ない、または欠乏したマグネトソーム産生のための最小限の成長培地を開発した。 . まず,マグネトソームを産生することなく,増殖前培地中でマグネトタクチック細菌を増幅した。 第二段階では、磁気捕獲細菌は、マグネトソーム合成を可能にするために含有する鉄に富む供給バッチ培地を供給した。 成長の50時間後、バイオマス濃度はOD565nm=8に達し、成長培地の約10mg/Lのマグネトソーム産生をもたらす。 Zn,Mn,B aおよびAlのマグネトソーム組成の有意な減少/消失を観察した。 鉄以外の不純物のない、または最も低い濃度のマグネトソーム製造のためのこの新しい戦略は、医療用途への道を開きます。

溶存酸素濃度

マグネトソームの生合成には、微小嫌気性または無酸素状態が必要です。 高密度培養は所望のマグネトソーム収率を得るために高い溶存酸素を必要とするため、低い溶存酸素レベルは細胞増殖に有意に影響する。 一方、溶存酸素の増加は培地中のMSR-1密度を増加させるが、マグネトソーム形成を阻害する可能性がある。 このように、マグネトソーム形成と細胞増殖との間に競合が存在し、高いMSR-1細胞密度と高いマグネトソーム収率を同時に達成することは困難である。 この対立は細胞の成長率の調節によって最適のレベルに分解された酸素を制御することによって幾分解決するかもしれません。 Jajan et al. 、5-10ppmの上のの分解された酸素のレベルで減らされた鉄の通風管およびマグネトソームの生産を報告しました。 しかし、溶存酸素が5-10ppm未満であると、鉄の取り込み速度とマグネトソームの産生が増加し、これはおそらく細菌の成長が遅いためであった。 Sunら。 MSR-1 42L発酵槽で強化されたマグネトソーム生産のための確立された大量培養,最適化されたフラスコ培地で,厳密な微好気条件を適用することによ この戦略は,低溶存酸素濃度で細胞増殖を調節し,高いマグネトソーム収率をもたらすため,マグネトソームの収量培養に有効であった。

AMB-1は、二つの呼吸経路を介して電子を伝達する通性嫌気性磁気接触細菌である。 好気性の成長の条件の下で、AMB-1は電子受容器として酸素を利用し、磁気粒子の形成を促進しないし、禁じます。 別の経路では、AMB-1は電子受容体として硝酸塩を使用するため、マグネトソーム形成を助長している低媒体酸化還元電位を必要とする。 Yangらによる研究では。 液相中の溶存酸素濃度が低い場合,マグネトソーム生成速度は高かった。 液相中の溶存酸素濃度が一定レベルを超えた場合(0.20ppm)、呼吸経路は好気性成長にシフトし、マグネトソーム産生の減少につながる。

溶存酸素濃度は、空気流量および攪拌速度によって強く影響される。 最初の成長段階の間の分解された酸素が気流およびstirring拌速度の増加によって上がるとき、分解された酸素が検出不可能なレベルに低下するまでマグネトソームの収率は低いままである。 MSR-1培養におけるこの現象を克服するためには、溶存酸素を攪拌することによって最適なレベルに増強し、細胞を呼吸によって溶存酸素を減少させ、 空気の流れと攪拌速度を最適化/調整することにより,高いマグネトソーム生成を達成した。 最初の培養段階の間に、溶存酸素は、これらの速度をそれぞれ1L分−1および200rpm分−1に維持することによって減少させた。 これらの条件下では、細胞は急速に成長し、溶存酸素は12時間で検出できなくなり、細胞密度はOD565nm=12.3で36時間に達した。乳酸ナトリウムおよびクエン酸第二鉄濃度は、プロセス中に3−6ミリモルL−1および70-110μ mol L-1の範囲でそれぞれ制御された。 マグネトソーム収率(83.23±5.36mg L−1)および生産性(55.49mg L−1日−1)の高い値は、このように達成された(表1)。

ME-1栽培では、溶存酸素を空気流量と攪拌速度に結合することによって0.5%の一定レベルでマグネトソーム生産を強化するように制御しました。 流加発酵中に、攪拌速度(50-300rpmの範囲)は、溶存酸素(0.5%)の一定レベルで大量のマグネトソームを生成した。 得られた細胞密度および49時間でのマグネトソーム収率は、6.5(OD565)および120mg L−1(湿潤重量)であった。 この戦略は、高いマグネトソーム収量と生産性を達成し、したがって、ME-1はマグネトソームの大規模な生産のための大きな可能性を秘めていることを示

低溶存酸素レベルは多くの研究で経験的に確立されているが、溶存酸素濃度の連続測定や培地中のそのコントロールの定義はない。 HeyenおよびSchülerは、oxystat操作のための発酵槽システムを使用してMSR-1培養基の低酸素の張力(po2)の自動制御のための方法を確立しました。 po2張力は磁鉄鉱形成と相関していた。 最も低い記録されたpo2値(0.25mbar;1bar=105Pa)は、マグネトソーム形成に最も有利であった。 オキシスタット条件下で増殖させた細胞は、有意に高いマグネタイト収率を示した(6.3mg L−1日−1)(表1)。

鉄イオン取り込み

鉄は、多くの酵素、特に主要な生物学的経路に関与する酵素の補因子として必要とされる。 細胞内の特定の鉄輸送機構は、最適な成長のために十分な鉄レベルを提供する。 いくつかの細菌は、第二鉄(Fe3+)を取るために第二鉄キレート剤(siderophoresと呼ばれる)を産生する。 マグネトタクチック細菌は,その成長に適した微小好気性条件を見いだした後,マグネタイトまたはグレイガイトからなるマグネトソームを合成する。 MSR-1では、マグネタイトはマグネトソームの主要成分であり、マグネトソームの生産は培地中のクエン酸第二鉄濃度によって有意に影響されない。 Jajan et al. 硫酸第一鉄はm.gryphiswaldenseに対してキネート第二鉄およびクエン酸第二鉄よりも鉄の良好な供給源であることを示した。 AMB−1の研究では、Yang e t a l. 鉄源として種々の硫酸第一鉄および第二鉄キレートを用い,その効果を比較した。 マグネトソーム産生は没食子酸第二鉄と硫酸塩によって有意に増強され,他の鉄源(キネート第二鉄,リンゴ酸第二鉄)および鉄取り込み速度によっても影響された。

第二鉄イオン(Fe3+)は、動的細胞増殖中に取り込まれ、培地中の溶存酸素レベルが検出されない場合に取り込まれる量はマグネトソーム形成と相関する。 マグネトソーム形成にはマイクロモル鉄濃度とマイクロ酸素条件が必要である。 MSR-1細胞は、酸素条件下では非磁性であるが、溶存酸素濃度が閾値(20mbarまたは検出不可能)を下回ると磁鉄鉱を生成し始める。 細胞増殖の対数期では、第二鉄イオンは急速に取り込まれ、その吸収率は>80%であり、マグネトソーム形成と相関している。

マグネトソーム合成はATPを消費する

ATPは、代謝、分子輸送、シグナル伝達、および他の重要な細胞生理学的プロセスに必要な普遍的なエネルギー源である。 マグネトソーム合成には大量のエネルギーが必要であり、鉄の取り込みはATPの利用可能性に依存する。 NADHはATPシンターゼによって触媒されるATPの生産に内部のmitochondrial膜を渡るプロトンの勾配を提供します。 NADH/NAD+比は対数相中のマグネトソーム成熟後に急速に増加する。

還元力はマグネトソーム合成中に有意に増加するが、過剰な還元力はマグネトソーム合成および細胞増殖を阻害する可能性がある。 MSR-1はpolyhydroxybutyrate(PHB)の統合および水素解放によって余分な減少力を消費できます。 MSR−1細胞は、PH B顆粒を含む。 MSR-1におけるPHBシンターゼ遺伝子のノックアウトは、マグネトソーム数の-30%の増加をもたらした。 このように、PHBとマグネトソーム合成プロセスとの間でエネルギー競争が起こる。 クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)プロモーターがAtpアーゼ遺伝子の下流発現を増加させることを実証するための遺伝子工学ツールとして,msrとmsr-NPHBのAtpアーゼ遺伝子の変異体を用いた。 MSR-1と比較して、MSR-NPHBは35%大きい加水分解活性、71%低いPHB蓄積、56%大きい酸素消費量、および40%大きい乳酸消費量を示した。 7.5LバイオリアクターにおけるMSR-NPHBの最大収率は58.4±6.4mg L-1であった。 これらの知見は、培養および成長培地の最適化/修飾と組み合わせてMSR-1の遺伝子操作を介して、マグネトソーム収量を強化し、生産コストと時間を短縮

スーパーオキシドジスムターゼ活性

マグネトソーム合成は、H2O2のin vitro破壊と、細胞におけるH2O2毒性に対する保護効果と関連している。 微生物では、酵素のsuperoxideのdismutaseは細胞の高分子に対する破壊的な効果をもたらすH2O2およびsuperoxideの陰イオンの根本的な(O2−)を破壊します。 マグネトタクチック細菌では,スーパーオキシドジスムターゼはまた,マグネトソーム形成中の酸化ストレスを減少させる。 H2O2は、第一鉄(Fe2+)から電子を受け取った後、ヒドロキシルラジカルを形成することができる。 ヒドロキシルラジカルは、生体分子を損傷する可能性のある活性酸素種(ROS)です。 Yangら。 また、対数後期に十分な溶存酸素と栄養素が利用可能である場合、マグネトソームの形成と成熟は細胞分裂速度に追いつくことができず、マグネトソームの希釈につながることを実証した。 スーパーオキシドジスムターゼ活性の低下は,希釈したROSの類似性に起因する可能性がある。 マグネトソームと人工磁性ナノ粒子は、ROSの掃気に関与し、この活性はまた、スーパーオキシドジスムターゼ活性の低下につながる可能性があります。

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