un Nutriente e bilanciata alimentazione

Il principale fattore che influenza la crescita di batteri magnetotattici, e di conseguenza mm di formazione, concentrazione di nutrienti, in particolare fonte di carbonio. Non è stato possibile estendere le condizioni medie ottimizzate determinate per la crescita di MSR-1 nella coltura di shake-flask direttamente alla coltura fermentatrice su scala di produzione di massa . Durante la coltura di MSR-1, l’accumulo di nutrienti eccessivi e componenti inibitori nel mezzo esercita effetti limitanti sulla crescita cellulare. Secondo la Legge del minimo di Liebig, la biomassa in un dato sistema è tipicamente limitata dalla quantità di un particolare nutriente, anche quando altri nutrienti sono presenti in eccesso .

Una strategia di alimentazione bilanciata dai nutrienti può ridurre l’effetto inibitorio di una quantità eccessiva di nutrienti nel mezzo. In questa strategia, l’accumulo di ioni Na+ e Cl è ridotto dalla sostituzione di fonti di carbonio e azoto. Nella coltura fed-batch, l’accumulo di ioni Na+ e Cl diminuisce il potenziale osmotico e di conseguenza inibisce la crescita cellulare. Anche una bassa concentrazione di NaCl (40 mm ) inibiva la crescita cellulare . Pertanto, una strategia di alimentazione bilanciata dai nutrienti può migliorare significativamente il tasso di crescita.

Liu et al. , ha stabilito una tecnica” della coltura del chemostat ” per coltivazione MSR-1 basata su alimentazione di pH-stat per mantenere la consistenza di azoto, carbonio e concentrazioni del ferro facendo uso di parecchi acidi organici. Condizioni microaerobiche sono state applicate per la coltivazione di MSR-1 in un sistema autofermentor fed-batch. Una soluzione nutritiva contenente (per litro) citrato ferrico (4,2 g), acido lattico (52,6 g), lattato di sodio (129 g) e NH4Cl (54,9 g) è stata utilizzata per l’alimentazione di pH-stat. Alti valori di rendimento del magnetosoma (83,23 ± 5,36 mg L− 1) e crescita cellulare (55,49 mg L− 1 giorno− 1) sono stati raggiunti a bassi livelli di lattato di sodio (Tabella 1). La tecnica della coltura del chemostato promuove efficientemente il rendimento del magnetosoma e la crescita delle cellule con tempo basso ed il costo energetico. Sono stati osservati effetti citotossici per eccessiva concentrazione di ossigeno disciolto (≥20 ppb) e presenza di acido lattico nel mezzo. Le strategie di controllo artificiale per i sistemi autofermentor devono essere adattate in relazione alle condizioni fisiologiche delle cellule. Allo stesso modo, Fernández-Castané et al. , ha dimostrato la strategia di crescita fed-batch pH-stat. In questa strategia sono state applicate varie concentrazioni di acido lattico (fonte di carbonio) e nitrato di sodio (accettore di elettroni) nel mangime. Le condizioni di crescita e la concentrazione intracellulare di ferro sono state ottimizzate in base alla concentrazione di biomassa. La più alta concentrazione di biomassa raggiunta a OD565 nm = 15,50 .

Tabella 1 Resa produzione di magnetosomi da parte dei batteri magnetotaici e loro condizioni

La crescita delle cellule MSR-1 e la formazione del magnetosoma sono alte quando il lattato di sodio è usato come fonte del carbonio. D’altra parte, è necessaria una bassa concentrazione di lattato di sodio per mantenere una bassa concentrazione di ossigeno disciolto per una rapida crescita cellulare e formazione di magnetosomi . Mantenere la concentrazione di lattato di sodio nello scale-up della produzione di massa è difficile e sono quindi necessarie strategie di alimentazione specifiche in laboratorio. NH4Cl ha dimostrato di essere una fonte di azoto migliore di NaNO3 .

Zhang et al. , rendimento massimo raggiunto del magnetosoma in MSR-1 facendo uso di una strategia semi-continua della coltura. Il mezzo di pallone ottimizzato è stato utilizzato in autofermentori da 7,5 e 42 L, è stata applicata una strategia di alimentazione bilanciata dai nutrienti e sono state sostituite fonti di carbonio e azoto per ridurre l’accumulo di ioni Na+ e Cl. Il potenziale osmotico è stato diminuito dall’accumulo di Na+ e Cl− ion, inibendo così la resa del magnetosoma e la crescita cellulare. Abbiamo raggiunto i valori massimi nella coltura fed-batch della resa del magnetosoma 356.52 mg L− 1 e crescita cellulare 9,16 g L-1 (Tabella 1).

Yang et al. , cellule coltivate AMB-1 in mezzo di crescita spirillum magnetico (MSGM) arricchito con L-cisteina, estratto di lievito e polipeptone. In questo sistema, la L-cisteina ha migliorato la crescita cellulare e ha ridotto la fase di ritardo, con conseguente elevata produzione di magnetosoma. L’aggiunta di solo estratto di lievito e polipeptone si traduce in una leggera produzione di magnetosomi. L’estratto di lievito non mostra alcun effetto significativo nella produzione di magnetosomi, mentre il polipeptone aumenta solo la densità cellulare finale . La ragione per una migliore produzione di magnetosomi da parte della L-cisteina è sconosciuta, tuttavia, si presume che la produzione di magnetosomi non sia associata a potenziali redox inferiori in presenza di L-cisteina . Inoltre, AMB-1 può crescere senza aminoacidi disponibili e le vie di sintesi della L-cisteina in AMB-1 possono non essere efficienti o correlate alla crescita cellulare. Pertanto, AMB-1 può utilizzare direttamente la L-cisteina invece di doverla sintetizzare per facilitare la crescita cellulare .

Ke et al. , magnetospirillo coltivato sp. ME-1 in mezzo di crescita arricchito con acetato di sodio, succinato di sodio, estratto di lievito, MgSO4, NH4Cl e citrato ferrico. ME-1 utilizza la fonte del carbonio per la crescita quali succinato, fumarato, ossaloacetato, piruvato, acetato, lattato, malato e peptone. Inoltre, ME-1 può crescere in assenza di fonte di azoto, tuttavia, la supplementazione di NH4Cl o NaNO3 migliora la crescita di ME-1. ME-1 mostra l’attività dell’ureasi e dell’ossidasi, suggerendo la capacità di crescita aerobica, tuttavia, la condizione aerobica inibisce la formazione del magnetosoma in ME-1 . La fermentazione fed-batch di ME-1 è stata ottimizzata a un livello costante di pH 6.8 in un fermentatore da 10 L basato sull’alimentazione pH-statica, fornendo al contempo le fonti di carbonio, azoto e ferro per la produzione su larga scala (Tabella 1).

Nonostante l’elevata resa dei magnetosomi, tali metodi sviluppati per la crescita dei batteri magnetotattici contengono componenti tossici nel mezzo di crescita. Questi componenti includono sostanze chimiche cancerogene, mutagene e tossiche per la riproduzione, metalli pesanti, agenti chelanti e ingredienti di origine animale non caratterizzati come l’estratto di lievito . C’è una grande necessità di ottenere una produzione su larga scala di magnetosomi puri con la più bassa quantità possibile di tali impurità o componenti tossici (altri metalli oltre al ferro). Pertanto, Berny et al. , sviluppato un mezzo di crescita minimo per la produzione di magnetosomi con meno o privo di componenti tossici e con proprietà magnetosomiche simili a quelle ottenute nelle migliori condizioni di crescita riportate da Zhang et al. . In primo luogo, i batteri magnetotattici sono stati amplificati nel mezzo di pre-crescita senza produrre magnetosomi . Nella seconda fase, i batteri magnetotattici sono stati quindi alimentati con un mezzo fed-batch ricco di ferro contenente per consentire la sintesi del magnetosoma . Dopo 50 h di crescita, la concentrazione di biomassa ha raggiunto a OD565 nm = 8 e produrre magnetosomi produzione di circa 10 mg / L di terreno di crescita. È stata osservata una significativa riduzione/scomparsa della composizione del magnetosoma di Zn, Mn, Ba e Al . Questa nuova strategia per la produzione di magnetosomi senza o più bassa concentrazione di impurità diverse dal ferro, apre la strada verso applicazioni mediche.

Concentrazione di ossigeno disciolto

La biosintesi del magnetosoma richiede condizioni microaerobiche o anossiche. Il basso livello di ossigeno disciolto influisce in modo significativo sulla crescita cellulare perché la coltura ad alta densità richiede un elevato ossigeno disciolto per ottenere la resa del magnetosoma desiderata. D’altra parte, l’aumento dell’ossigeno disciolto può aumentare la densità MSR-1 nel mezzo di coltura ma inibire la formazione del magnetosoma . Esiste quindi un conflitto tra la formazione del magnetosoma e la crescita cellulare, rendendo difficile raggiungere simultaneamente un’elevata densità cellulare MSR-1 e un’elevata resa del magnetosoma. Questo conflitto può essere risolto un po ‘ controllando l’ossigeno disciolto ad un livello ottimale attraverso la regolazione del tasso di crescita cellulare. Jajan et al. , ha riferito l’assorbimento di ferro ridotto e la produzione di magnetosomi al livello di ossigeno disciolto superiore a 5-10 ppm. Tuttavia, quando l’ossigeno disciolto era inferiore a 5-10 ppm, il tasso di assorbimento del ferro e la produzione di magnetosomi erano aumentati, probabilmente a causa della lenta crescita dei batteri . Sun et al. , cultura di massa stabilita di MSR-1 per produzione migliorata del magnetosoma in un fermentor 42-L, con il medium ottimizzato della fiaschetta, applicando le circostanze microaerobiche rigorose (concentrazione disciolta quasi zero dell’ossigeno) ed usando il citrato ferrico ed il lattato del sodio come fonti del carbonio e del ferro nel medium. Questa strategia è stata efficace per la coltivazione del rendimento dei magnetosomi perché la crescita delle cellule è stata regolata a bassa concentrazione di ossigeno disciolto, con conseguente rendimento elevato del magnetosoma.

AMB-1 è un batterio magnetotattico anaerobico facoltativo che trasferisce elettroni attraverso due vie respiratorie. In condizioni di crescita aerobica, AMB-1 utilizza l’ossigeno come accettore di elettroni e non promuove né inibisce la formazione di particelle magnetiche. In una via alternativa, AMB-1 usa il nitrato come accettore dell’elettrone e quindi richiede i potenziali redox bassi di media, che sono favorevoli alla formazione del magnetosoma. In uno studio condotto da Yang et al. , il tasso di produzione del magnetosoma era alto nell’ambito della concentrazione disciolta bassa dell’ossigeno nella fase liquida. Quando la concentrazione di ossigeno disciolto in fase liquida superato un certo livello (0.20 ppm), la via respiratoria si è spostata verso la crescita aerobica, portando a una riduzione della produzione di magnetosomi.

La concentrazione di ossigeno disciolto è fortemente influenzata dalla portata d’aria e dalla velocità di agitazione. Quando l’ossigeno disciolto durante la fase iniziale di crescita viene sollevato aumentando il flusso d’aria e le velocità di agitazione, la resa del magnetosoma rimane bassa fino a quando l’ossigeno disciolto non diminuisce a un livello non rilevabile. Per superare questo fenomeno nella coltivazione di MSR-1, l’ossigeno disciolto deve essere potenziato ad un livello ottimale mescolando, e le cellule hanno quindi permesso di ridurre l’ossigeno disciolto attraverso la respirazione, fino a raggiungere il livello ottimale per la formazione del magnetosoma. L’elevata produzione di magnetosomi è stata ottenuta ottimizzando / regolando il flusso d’aria e le velocità di agitazione . Durante la fase iniziale di coltura, l’ossigeno disciolto è stato ridotto mantenendo queste velocità rispettivamente a 1 L min-1 e 200 rpm min-1. Durante la cultura successiva fase, l’ossigeno disciolto è stato aumentato di regolazione della portata di aria a 2 L min− 1 a 20 h e mescolando tasso a 300 rpm min− 1 a 28 h. In queste condizioni, le cellule sono cresciute rapidamente, ossigeno disciolto diventano non rilevabili a 12 h, e la densità delle cellule raggiunto OD565 nm = 12,3 a 36 h. Lattato di sodio e citrato ferrico concentrazioni sono stati controllati rispettivamente negli intervalli di 3-6 mmol L− 1 e 70-110 µmol L− 1 durante il processo. Sono stati così raggiunti valori elevati di rendimento del magnetosoma (83,23 ± 5,36 mg L− 1) e produttività (55,49 mg L− 1 giorno− 1) (Tabella 1).

Nella coltivazione di ME-1, l’ossigeno disciolto è stato controllato per migliorare la produzione del magnetosoma ad un livello costante dello 0,5% accoppiandosi alla portata d’aria e alla velocità di agitazione. Durante la fermentazione in batch, una velocità di agitazione (nell’intervallo 50-300 rpm) ha prodotto una grande quantità di magnetosomi a livello costante di ossigeno disciolto (0,5%). La densità cellulare risultante e la resa del magnetosoma a 49 h erano 6,5 (OD565) e 120 mg L− 1 (peso umido). Questa strategia ha raggiunto un’elevata resa e produttività del magnetosoma, indicando così che ME-1 ha un grande potenziale per la produzione su larga scala di magnetosomi .

Bassi livelli di ossigeno disciolto sono stati stabiliti empiricamente in molti studi, ma senza misurazione continua della concentrazione di ossigeno disciolto o definizione del suo controllo nel mezzo. Heyen e Schüler, hanno stabilito un metodo per il controllo automatico della bassa tensione di ossigeno (pO2) nel mezzo di coltura MSR-1 utilizzando un sistema fermentatore per il funzionamento di oxystat. La tensione pO2 era correlata con la formazione di magnetite. Il valore PO2 più basso registrato (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) è stato il più favorevole per la formazione del magnetosoma. Le cellule coltivate in condizioni di oxystat hanno mostrato una resa di magnetite significativamente più elevata (6,3 mg L− 1 giorno− 1) (Tabella 1).

Assorbimento di ioni ferrici

Il ferro è richiesto come cofattore per molti enzimi, in particolare quelli coinvolti nelle principali vie biologiche. Specifici meccanismi di trasporto del ferro nelle cellule forniscono livelli di ferro sufficienti per una crescita ottimale. Alcuni batteri producono chelanti ferrici (chiamati siderofori) per assumere ferro ferrico (Fe3+). I batteri magnetotattici sintetizzano i magnetosomi composti da magnetite o greigite dopo aver trovato condizioni microaerofile adatte alla loro crescita . Nell’MSR-1, la magnetite è il componente principale dei magnetosomi e la produzione del magnetosoma non è quindi significativamente influenzata dalla concentrazione di citrato ferrico nel mezzo di coltura. Jajan et al. , ha indicato che il solfato ferroso era una migliore fonte di ferro che il quinate ferrico ed il citrato ferrico per M. gryphiswaldense . In uno studio di AMB-1, Yang et al. , usato vari solfato ferroso e chelati ferrici come fonti di ferro, e confrontato i loro effetti. La produzione del magnetosoma è stata significativamente migliorata dal gallato ferrico e dal solfato ed è stata anche influenzata da altre fonti di ferro (quinato ferrico, malato ferrico) e dal tasso di assorbimento del ferro.

Lo ion ferrico (Fe3+) viene assorbito durante la crescita dinamica delle cellule e la quantità assorbita è correlata alla formazione del magnetosoma quando il livello di ossigeno disciolto nel mezzo non è rilevabile. La formazione del magnetosoma richiede concentrazione di ferro micromolare e condizioni microossiche . Le cellule MSR-1 non sono magnetiche in condizioni ossiche, ma iniziano a produrre magnetite quando la concentrazione di ossigeno disciolto scende al di sotto di un valore soglia (20 mbar o non rilevabile). Nella fase di log della crescita cellulare, lo ion ferrico viene assorbito rapidamente e il suo tasso di assorbimento è > 80% e correlato alla formazione del magnetosoma .

La sintesi del magnetosoma consuma ATP

L’ATP è la fonte di energia universale necessaria per il metabolismo, il trasporto molecolare, la trasduzione del segnale e altri processi fisiologici cellulari cruciali. La sintesi del magnetosoma richiede una grande quantità di energia e l’assorbimento del ferro dipende dalla disponibilità di ATP. NADH fornisce un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale interna per la produzione di ATP catalizzata dall’ATP sintasi . Il rapporto NADH / NAD+ aumenta rapidamente dopo la maturazione del magnetosoma durante la fase di log.

La riduzione della potenza aumenta significativamente durante la sintesi del magnetosoma; tuttavia, un eccessivo potere riducente può inibire la sintesi del magnetosoma e la crescita cellulare . MSR-1 può consumare un eccessivo potere riducente attraverso la sintesi di poliidrossibutirrato (PHB) e il rilascio di idrogeno . Le cellule MSR-1 contengono granuli di PHB . Knockout del gene PHB sintasi in MSR-1 ha provocato ~ 30% aumento del numero di magnetosoma . La competizione energetica si verifica quindi tra PHB e il processo di sintesi del magnetosoma. Un mutante del gene ATPasi di MSR e MSR-NPHB creato mediante coniugazione è stato utilizzato come strumento di ingegneria genetica per dimostrare che il promotore della cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT) aumenta l’espressione a valle del gene ATPasi. In confronto con MSR-1, MSR-NPHB ha mostrato una maggiore attività di idrolisi del 35%, un accumulo di PHB inferiore del 71%, un consumo di ossigeno maggiore del 56% e un consumo di lattato maggiore del 40%. La resa massima di MSR-NPHB in un bioreattore da 7,5 L è stata di 58,4 ± 6,4 mg L-1 . Questi risultati dimostrano che la resa del magnetosoma può essere migliorata e il costo e il tempo di produzione ridotti, attraverso la manipolazione genetica di MSR-1 in combinazione con l’ottimizzazione/ modifica dei terreni di coltura e di crescita.

Attività della superossido dismutasi

La sintesi del magnetosoma è associata alla degradazione in vitro di H2O2 e agli effetti protettivi contro la tossicità H2O2 nelle cellule. Nei microrganismi, l’enzima superossido dismutasi scompone H2O2 e il radicale anionico superossido (O2 -), entrambi i quali hanno effetti distruttivi sulle macromolecole cellulari . Nei batteri magnetotattici, la superossido dismutasi riduce anche lo stress ossidativo durante la formazione del magnetosoma. H2O2 può formare un radicale idrossilico dopo aver ricevuto un elettrone dal ferro ferroso (Fe2+). Il radicale idrossilico è la specie reattiva dell’ossigeno (ROS) che può danneggiare le biomolecole . Yang et al. , ha dimostrato che quando l’ossigeno disciolto sufficiente ed i nutrienti sono disponibili nella fase tardiva del log, la formazione e la maturazione del magnetosoma non sono in grado di raggiungere il tasso di divisione cellulare, portando alla diluizione dei magnetosomi. La riduzione dell’attività della superossido dismutasi può quindi derivare dalla somiglianza del ROS diluito. I magnetosomi, così come le nanoparticelle magnetiche artificiali, partecipano allo scavenging del ROS e questa attività può anche portare a una ridotta attività della superossido dismutasi.

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