tápanyag-kiegyensúlyozott táplálás

a magnetotaktikus baktériumok növekedését és következésképpen a magnetoszómák képződését befolyásoló fő tényező a tápanyagok koncentrációja, különösen a szénforrás. Nem lehetett kiterjeszteni az MSR-1 növekedésre meghatározott optimalizált közegfeltételeket shake-lombik tenyészetben közvetlenül a tömegtermelési léptékű fermentor tenyészetre . Az MSR – 1 tenyésztés során a túlzott tápanyagok és gátló komponensek felhalmozódása a táptalajban sebességkorlátozó hatást fejt ki a sejtnövekedésre. Liebig minimális törvénye szerint a biomasszát egy adott rendszerben általában egy adott tápanyag mennyisége korlátozza, még akkor is, ha más tápanyagok feleslegben vannak jelen .

a tápanyag-kiegyensúlyozott táplálkozási stratégia csökkentheti a tápközegben lévő túlzott mennyiségű tápanyag gátló hatását. Ebben a stratégiában a Na+ és Cl− ionok felhalmozódását a szén-és nitrogénforrások helyettesítésével csökkentik. Táplált kötegelt tenyészetben a Na+ és Cl− ionok felhalmozódása csökkenti az ozmotikus potenciált, következésképpen gátolja a sejtnövekedést. Még egy alacsony NaCl-koncentráció (40 mM ) gátolta a sejtek növekedését . Így a tápanyag-kiegyensúlyozott táplálkozási stratégia jelentősen növelheti a növekedési sebességet.

Liu et al. , létrehozott egy” kemosztátkultúra ” technikát az MSR – 1 termesztésére, amely pH-stat etetésen alapul, hogy fenntartsa a nitrogén, a szén és a vas koncentrációjának konzisztenciáját több szerves sav felhasználásával. Mikroaerob feltételeket alkalmaztak az MSR – 1 termesztésére egy fed-batch autofermentor rendszerben. A pH-stat tápláláshoz (literenként) vas-citrátot (4,2 g), tejsavat (52,6 g), nátrium-laktátot (129 g) és NH4Cl-t (54,9 g) tartalmazó tápoldatot használtunk. A magnetoszóma hozam (83,23 6,36 mg l− 1) és a sejtnövekedés (55,49 mg L− 1 nap− 1) magas értékeit alacsony nátrium-laktát szint mellett érték el (1.táblázat). A kemosztát tenyésztési technika hatékonyan elősegíti a magnetoszóma hozamát és a sejtek növekedését alacsony idő – és energiaköltséggel. Citotoxikus hatást figyeltek meg a túlzott oldott oxigénkoncentráció (60 ppb) és a tejsav közegben való jelenléte miatt. Az autofermentor rendszerek mesterséges ellenőrzési stratégiáit a sejtek fiziológiai állapotához kell igazítani. Hasonlóképpen, Páfrány (Páfrány) – Castan (kasztán) stb. , bemutatta a pH-stat fed-batch növekedési stratégiát. Ebben a stratégiában a tejsav (szénforrás) és a nátrium-nitrát (elektron akceptor) különböző koncentrációit alkalmazták a takarmányban. A növekedési feltételeket és az intracelluláris vaskoncentrációt a biomassza koncentrációjának megfelelően optimalizáltuk. A legmagasabb biomassza-koncentráció elérte az OD565 nm = 15,50 értéket .

1. táblázat a magnetoszómák termelődése magnetotaikus baktériumok által és azok körülményei

az MSR-1 sejtek növekedése és a magnetoszóma kialakulása magas, ha nátrium-laktátot használnak szénforrásként. Másrészt alacsony nátrium-laktát koncentrációra van szükség az alacsony oldott oxigénkoncentráció fenntartásához a gyors sejtnövekedéshez és a magnetoszóma képződéshez . A nátrium-laktát koncentrációjának fenntartása a tömegtermelésben nehéz, ezért a laboratóriumban speciális etetési stratégiákra van szükség. Kimutatták, hogy az NH4Cl jobb nitrogénforrás, mint a NaNO3 .

Zhang et al. , maximális magnetoszóma hozamot ért el MSR-1-ben félig folyamatos tenyésztési stratégia alkalmazásával. 7,5 és 42 literes autofermentorokban optimalizált lombikközeget alkalmaztak, tápanyag – kiegyensúlyozott táplálkozási stratégiát alkalmaztak, és szén-és nitrogénforrásokat cseréltek a Na+ és Cl-ionok felhalmozódásának csökkentése érdekében. Az ozmotikus potenciált csökkentette a Na+ és a Cl− ion akkumuláció, ezáltal gátolva a magnetoszóma hozamát és a sejtnövekedést. Maximális értékeket értünk el a 356 magnetoszóma hozam fed-kötegelt kultúrájában.52 mg L− 1 és 9,16 G L− 1 sejtnövekedés (1.táblázat).

Yang et al. , tenyésztett AMB-1 sejtek l-ciszteinnel, élesztőkivonattal és polipeptonnal dúsított mágneses spirillum növekedési közegben (MSGM). Ebben a rendszerben az L-cisztein fokozta a sejtnövekedést és csökkentette a lag fázist, ami magas magnetoszóma termelést eredményezett. Csak élesztőkivonat és polipepton hozzáadása a magnetoszómák kismértékű termelését eredményezi. Az élesztőkivonat nem mutat jelentős hatást a magnetoszóma termelésében, míg a polipepton csak növeli a végső sejtsűrűséget . A magnetoszómák L-cisztein általi jobb termelésének oka nem ismert, azonban feltételezzük, hogy a magnetoszómák termelése nem kapcsolódik alacsonyabb redox potenciálhoz L-cisztein jelenlétében . Ezenkívül az AMB-1 növekedhet a rendelkezésre álló aminosavak nélkül, és az AMB-1 L-cisztein szintézis útvonalai nem hatékonyak vagy a sejtnövekedéshez kapcsolódnak. Ezért az AMB-1 közvetlenül felhasználhatja az L-ciszteint, ahelyett, hogy szintetizálná a sejtnövekedés megkönnyítése érdekében .

Ke et al. , tenyésztett Magnetospirillum sp. ME-1 nátrium-acetáttal, nátrium-szukcináttal, élesztőkivonattal, MgSO4, NH4Cl és vas-citráttal dúsított táptalajban. A ME-1 szénforrást használ a növekedéshez, mint például szukcinát, fumarát, oxaloacetát, piruvát, acetát, Laktát, malát és pepton. Ezenkívül a ME-1 nitrogénforrás hiányában is növekedhet, azonban az NH4Cl vagy a NaNO3 kiegészítés fokozza a ME-1 növekedést. A ME-1 ureáz és oxidáz aktivitást mutat, ami az aerob növekedés képességére utal, azonban az aerob állapot gátolja a magnetoszóma képződését a ME-1-ben . A ME-1 adagolt fermentációját állandó pH 6,8-os pH-értéken optimalizáltuk egy 10 literes fermentorban, pH-statikus táplálás alapján, miközben a szén -, nitrogén-és vasforrásokat elláttuk a nagyüzemi termeléshez (1.táblázat).

a magnetoszómák magas hozama ellenére a magnetotaktikus baktériumok szaporodására kifejlesztett ilyen módszerek mérgező komponenseket tartalmaznak a táptalajban. Ezek az összetevők karcinogén, mutagén és reprotoxikus vegyi anyagokat, nehézfémeket, kelátképző szereket és nem jellemzett állati eredetű összetevőket, például élesztőkivonatot tartalmaznak . Nagy szükség van a tiszta magnetoszómák nagy léptékű előállítására, a lehető legkisebb mennyiségű ilyen szennyeződéssel vagy mérgező komponenssel (más fémek, mint a vas). Ezért Berny et al. , kifejlesztett egy minimális növekedési táptalajt a magnetoszómák termeléséhez, kevesebb toxikus komponenssel vagy anélkül, és hasonló magnetoszóma tulajdonságokkal rendelkezik, mint amelyeket Zhang et al. . Először is, a magnetotaktikus baktériumokat a növekedés előtti táptalajban amplifikáltuk magnetoszómák előállítása nélkül . A második lépésben a magnetotaktikus baktériumokat ezután vasban gazdag táplált kötegelt közeggel tápláltuk, amely lehetővé tette a magnetoszóma szintézisét . 50 óra növekedés után a biomassza koncentrációja elérte az OD565 nm = 8 értéket, és a magnetoszómák termelése körülbelül 10 mg/L növekedési közeg. Szignifikáns csökkenést / eltűnést figyeltek meg a Zn, Mn, Ba és Al magnetoszóma összetételében . Ez az új stratégia a magnetoszómák termelésére a vas kivételével, vagy a legalacsonyabb koncentrációjú szennyeződések nélkül, előkészíti az utat az orvosi alkalmazások felé.

oldott oxigén koncentráció

a Magnetoszóma bioszintézise mikroaerob vagy anoxikus körülményeket igényel. Az alacsony oldott oxigénszint jelentősen befolyásolja a sejtek növekedését, mivel a nagy sűrűségű tenyészethez magas oldott oxigén szükséges a kívánt magnetoszóma hozam eléréséhez. Másrészt a megnövekedett oldott oxigén növelheti az MSR-1 sűrűségét a táptalajban, de gátolhatja a magnetoszóma képződését . A magnetoszóma kialakulása és a sejtnövekedés között konfliktus áll fenn, ami megnehezíti a magas MSR-1 sejtsűrűség és a magas magnetoszóma hozam egyidejű elérését. Ez a konfliktus némileg megoldható az oldott oxigén optimális szintre történő szabályozásával a sejt növekedési sebességének beállításával. Jajan et al. , beszámolt a csökkent vasfelvételről és a magnetoszómák termeléséről az oldott oxigénszint felett 5-10 ppm. Azonban, amikor az oldott oxigén alacsonyabb volt, mint 5-10 ppm, a vasfelvétel sebessége és a magnetoszómák termelése nőtt, ami valószínűleg a baktériumok lassú növekedésének köszönhető . Sun et al. , MSR-1 tömegkultúrája a fokozott magnetoszóma termeléshez 42 literes fermentorban, optimalizált lombik közegben, szigorú mikroaerob körülmények alkalmazásával (közel nulla oldott oxigénkoncentráció), vas-citrát és nátrium-laktát felhasználásával vas-és szénforrásként közegben. Ez a stratégia hatékony volt a magnetoszómák terméstermesztésében, mivel a sejtnövekedést alacsony oldott oxigénkoncentráció mellett szabályozták, ami magas magnetoszóma hozamot eredményezett.

az AMB-1 egy fakultatív anaerob magnetotaktikus baktérium, amely két légzési úton továbbítja az elektronokat. Aerob növekedési körülmények között az AMB-1 oxigént használ elektron akceptorként, és sem elősegíti, sem gátolja a mágneses részecskék képződését. Alternatív módon az AMB-1 nitrátot használ elektron akceptorként, ezért alacsony média redox potenciált igényel, amelyek elősegítik a magnetoszóma képződését. Egy tanulmányban Yang et al. , a magnetoszóma termelési sebessége magas volt alacsony oldott oxigénkoncentráció mellett folyékony fázisban. Amikor az oldott oxigén koncentrációja folyékony fázisban meghaladta egy bizonyos szintet (0.20 ppm), a légzési út aerob növekedésre váltott, ami csökkent magnetoszóma termeléshez vezetett.

az oldott oxigén koncentrációját erősen befolyásolja a levegő áramlási sebessége és a keverési sebesség. Amikor az oldott oxigént a kezdeti növekedési fázisban a levegőáramlás és a keverési sebesség növelésével emelik, a magnetoszóma hozama alacsony marad, amíg az oldott oxigén kimutathatatlan szintre csökken. Ennek a jelenségnek az MSR-1 termesztésben történő leküzdése érdekében az oldott oxigént keverés útján optimális szintre kell növelni, majd a sejteket légzéskor hagyni kell az oldott oxigén csökkentésére, amíg el nem éri a magnetoszóma képződéséhez optimális szintet. A magas magnetoszóma termelést a levegőáramlás és a keverési sebesség optimalizálásával/ beállításával sikerült elérni . A kezdeti tenyésztési fázisban az oldott oxigént csökkentettük úgy, hogy ezeket a sebességeket 1 L min− 1, illetve 200 rpm min− 1-en tartottuk. A későbbi tenyésztési fázisban az oldott oxigént úgy növeltük, hogy a levegő áramlási sebességét 2 L min− 1− re állítottuk be 20 órán át, a keverési sebességet pedig 300 rpm min− 1− re 28 órán át. ilyen körülmények között a sejtek gyorsan növekedtek, az oldott oxigén 12 órán keresztül kimutathatatlanná vált, és a sejtsűrűség elérte az OD565 nm = 12,3 értéket 36 órán keresztül. a nátrium-laktát és a vas-citrát koncentrációját a folyamat során a 3-6 mmol L-1 és a 70-110 mmol L-1 tartományban szabályoztuk. Így a magnetoszóma hozamának (83,23 kb 5,36 mg L− 1) és termelékenységének (55,49 mg L− 1 nap− 1) magas értékeit érték el (1.táblázat).

ME-1 termesztésben az oldott oxigént úgy szabályoztuk, hogy a magnetoszóma termelését állandó, 0,5%-os szinten fokozzuk a levegő-áramlási sebességhez és a keverési sebességhez kapcsolódva. A táplált szakaszos fermentáció során a keverési sebesség (50-300 fordulat / perc tartományban) nagy mennyiségű magnetoszómát eredményezett állandó oldott oxigén szinten (0,5%). A kapott sejtsűrűség és magnetoszóma hozam 49 óra után 6,5 (OD565) és 120 mg L− 1 (nedves tömeg) volt. Ez a stratégia magas magnetoszóma hozamot és termelékenységet ért el, ami azt jelzi, hogy a ME-1 nagy potenciállal rendelkezik a magnetoszómák nagy léptékű előállításában .

alacsony oldott oxigénszinteket empirikusan állapítottak meg számos tanulmányban, de az oldott oxigén koncentrációjának folyamatos mérése vagy a közegben történő szabályozásának meghatározása nélkül. Heyen és Schauller létrehozott egy módszert az alacsony oxigénfeszültség (pO2) automatikus szabályozására MSR-1 táptalajban egy fermentor rendszer alkalmazásával az oxisztát működéséhez. a pO2 feszültség korrelált a magnetit képződésével. A legalacsonyabb rögzített pO2 érték (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) volt a legkedvezőbb a magnetoszóma képződéséhez. Az oxisztát körülmények között tenyésztett sejtek szignifikánsan magasabb magnetithozamot mutattak (6,3 mg L− 1 nap− 1) (1.táblázat).

vasion felvétel

vas szükséges kofaktorként számos enzimhez, különösen azokhoz, amelyek részt vesznek a fő biológiai útvonalakon. A sejtekben a specifikus vasszállítási mechanizmusok biztosítják az Optimális növekedéshez elegendő vasszintet. Egyes baktériumok vas-kelátorokat (úgynevezett siderophores) termelnek, hogy vas-vasat (Fe3+) vegyenek fel. A magnetotaktikus baktériumok szintetizálják a magnetitből vagy greigitből álló magnetoszómákat, miután megtalálják a növekedésükhöz megfelelő mikroaerofil körülményeket . Az MSR-1-ben a magnetit a magnetoszómák fő alkotóeleme, ezért a táptalajban a vas-citrát koncentrációja nem befolyásolja jelentősen a magnetoszómák termelését. Jajan et al. , kimutatta, hogy a vas-szulfát jobb vasforrás volt, mint a vas-quinát és a vas-citrát az M. gryphiswaldense számára . Az AMB-1 tanulmányában Yang et al. , különböző vas-szulfátot és vas-kelátokat használt vasforrásként, és összehasonlította azok hatásait. A magnetoszóma termelését jelentősen javította a vas-gallát és a szulfát, és más vasforrás (vas-quinát, vas-malát) és a vasfelvétel sebessége is befolyásolta.

a vasion (Fe3+) a dinamikus sejtnövekedés során kerül felvételre, és a felvett mennyiség korrelál a magnetoszóma képződésével, amikor az oldott oxigén szintje a közegben nem észlelhető. A magnetoszóma kialakulása mikromoláris vaskoncentrációt és mikrooxikus körülményeket igényel . Az MSR-1 sejtek oxikus körülmények között nem mágnesesek, de akkor kezdenek magnetit termelni, amikor az oldott oxigén koncentrációja küszöbérték alá esik (20 mbar vagy nem észlelhető). A sejtnövekedés log fázisában a vasion gyorsan felszívódik, abszorpciós sebessége > 80%, és korrelál a magnetoszóma képződésével .

a Magnetoszóma szintézis ATP-t fogyaszt

az ATP az anyagcseréhez, a molekuláris szállításhoz, a jelátvitelhez és más fontos sejtfiziológiai folyamatokhoz szükséges univerzális energiaforrás. A magnetoszóma szintézise nagy mennyiségű energiát igényel, a vasfelvétel pedig az ATP elérhetőségétől függ. A NADH protongradienst biztosít a belső mitokondriális membránon keresztül az ATP-szintáz által katalizált ATP-termeléshez . A NADH/ NAD + Arány gyorsan növekszik a magnetoszóma érését követően a log fázisban.

a redukáló teljesítmény jelentősen megnő a magnetoszóma szintézis során; azonban a túlzott redukáló teljesítmény gátolhatja a magnetoszóma szintézist és a sejtnövekedést . Az MSR – 1 túlzott redukáló energiát fogyaszt a polihidroxi-butirát (PHB) szintézis és a hidrogén felszabadulása révén . Az MSR-1 sejtek PHB granulátumot tartalmaznak . A PHB szintáz gén kiesése az MSR-1-ben a magnetoszóma számának ~ 30% – os növekedését eredményezte . Az energiaverseny tehát a PHB és a magnetoszóma szintézis folyamata között zajlik. A konjugációval létrehozott MSR és MSR-NPHB ATPáz gén mutánsát használták géntechnikai eszközként annak bizonyítására, hogy a kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) promoter növeli az ATPáz gén downstream expresszióját. Az MSR-1-hez képest az MSR-NPHB 35% – kal nagyobb hidrolízis aktivitást, 71% – kal alacsonyabb PHB felhalmozódást, 56% – kal nagyobb oxigénfogyasztást és 40% – kal nagyobb laktátfogyasztást mutatott. Az MSR – NPHB maximális hozama egy 7,5 literes bioreaktorban 58,4 6,4 mg l-1 volt . Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a magnetoszóma hozama növelhető, és a termelési költség és az idő csökkenthető az MSR-1 genetikai manipulációjával, kombinálva a tenyészet és a növekedési közeg optimalizálásával/ módosításával.

szuperoxid-diszmutáz aktivitás

a Magnetoszóma szintézise a H2O2 in vitro lebontásával és a sejtekben a H2O2 toxicitás elleni védőhatással jár. Mikroorganizmusokban a szuperoxid-diszmutáz enzim lebontja a H2O2− t és a szuperoxid-aniongyököt (O2 -), mindkettő romboló hatással van a sejt makromolekuláira . Magnetotaktikus baktériumokban a szuperoxid-diszmutáz csökkenti az oxidatív stresszt is a magnetoszóma kialakulása során. H2O2 hidroxilgyököt képezhet, miután elektronot kapott vasból (Fe2+). A hidroxilgyök a reaktív oxigénfajok (ROS), amelyek károsíthatják a biomolekulákat . Yang et al. kimutatták, hogy ha elegendő oldott oxigén és tápanyag áll rendelkezésre a késői log fázisban, a magnetoszómák képződése és érése nem képes felzárkózni a sejtosztódási sebességhez, ami a magnetoszómák hígításához vezet. A szuperoxid-diszmutáz aktivitás csökkenése tehát a hígított ROS hasonlóságából eredhet. A magnetoszómák, valamint a mesterséges mágneses nanorészecskék részt vesznek a ROS eltávolításában, és ez a tevékenység a szuperoxid-diszmutáz aktivitás csökkenéséhez is vezethet.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.