Alimentation équilibrée en nutriments

Le facteur principal affectant la croissance des bactéries magnétotactiques, et par conséquent la formation de magnétosomes, est la concentration de nutriments, en particulier la source de carbone. Il n’a pas été possible d’étendre directement les conditions de milieu optimisées déterminées pour la croissance du MSR-1 dans la culture en flacon à agitation à la culture de fermenteurs à l’échelle de la production de masse. Au cours de la culture MSR-1, l’accumulation de nutriments excessifs et de composants inhibiteurs dans le milieu exerce des effets limiteurs de vitesse sur la croissance cellulaire. Selon la Loi du Minimum de Liebig, la biomasse dans un système donné est généralement limitée par la quantité d’un nutriment particulier, même lorsque d’autres nutriments sont présents en excès.

Une stratégie d’alimentation équilibrée en nutriments peut réduire l’effet inhibiteur d’une quantité excessive de nutriments dans le milieu. Dans cette stratégie, l’accumulation d’ions Na + et Cl− est réduite par le remplacement des sources de carbone et d’azote. En culture par lots nourris, l’accumulation d’ions Na+ et Cl- diminue le potentiel osmotique et inhibe par conséquent la croissance cellulaire. Même une faible concentration de NaCl (40 mM) inhibait la croissance cellulaire. Ainsi, une stratégie d’alimentation équilibrée en nutriments peut améliorer considérablement le taux de croissance.

Liu et coll. , a établi une technique de « culture de chimiostat » pour la culture de MSR-1 basée sur l’alimentation pH-stat pour maintenir la consistance des concentrations d’azote, de carbone et de fer en utilisant plusieurs acides organiques. Des conditions microaérobies ont été appliquées pour la culture du MSR-1 dans un système d’autofermenteur par lots nourris. Une solution nutritive contenant (par litre) du citrate ferrique (4,2 g), de l’acide lactique (52,6 g), du lactate de sodium (129 g) et du NH4Cl (54,9 g) a été utilisée pour l’alimentation pH-stat. Des valeurs élevées de rendement en magnétosomes (83,23 ± 5,36 mg L−1) et de croissance cellulaire (55,49 mg L−1 jour−1) ont été obtenues à faible taux de lactate de sodium (tableau 1). La technique de culture de chimiostat favorise efficacement le rendement en magnétosomes et la croissance cellulaire avec un faible coût en temps et en énergie. Des effets cytotoxiques ont été observés pour une concentration excessive d’oxygène dissous (≥ 20 ppb) et la présence d’acide lactique dans le milieu. Les stratégies de contrôle artificiel des systèmes autofermenteurs doivent être ajustées en fonction de l’état physiologique des cellules. De même, Fernández-Castané et coll. , a démontré la stratégie de croissance par lots de la fed pH-stat. Dans cette stratégie, diverses concentrations d’acide lactique (source de carbone) et de nitrate de sodium (accepteur d’électrons) ont été appliquées dans la charge. Les conditions de croissance et la concentration intracellulaire en fer ont été optimisées en fonction de la concentration de biomasse. La concentration de biomasse la plus élevée a atteint OD565 nm = 15,50.

Tableau 1 Production de rendement de magnétosomes par les bactéries magnétotaïques et leurs conditions

La croissance cellulaire MSR-1 et la formation de magnétosomes sont élevées lorsque le lactate de sodium est utilisé comme source de carbone. D’autre part, une faible concentration de lactate de sodium est nécessaire pour maintenir une faible concentration d’oxygène dissous pour une croissance cellulaire rapide et la formation de magnétosomes. Le maintien de la concentration de lactate de sodium dans la production de masse est difficile et des stratégies d’alimentation spécifiques sont donc nécessaires en laboratoire. Il a été démontré que le NH4Cl est une meilleure source d’azote que le NaNO3.

Zhang et coll. , a atteint un rendement maximal de magnétosomes dans MSR-1 en utilisant une stratégie de culture semi-continue. Un milieu de flacon optimisé a été utilisé dans les autofermenteurs de 7,5 et 42 L, une stratégie d’alimentation équilibrée en nutriments a été appliquée et des sources de carbone et d’azote ont été remplacées pour réduire l’accumulation d’ions Na + et Cl−. Le potentiel osmotique a été diminué par l’accumulation d’ions Na+ et Cl−, inhibant ainsi le rendement en magnétosomes et la croissance cellulaire. Nous avons atteint des valeurs maximales en culture par lots nourris de rendement en magnétosomes 356.52 mg L−1 et croissance cellulaire 9,16 g L-1 (tableau 1).

Yang et al. , cellules AMB-1 cultivées dans un milieu de croissance magnétique à spiruline (MSGM) enrichi en L-cystéine, extrait de levure et polypeptone. Dans ce système, la L-cystéine a amélioré la croissance cellulaire et réduit la phase de retard, ce qui a entraîné une production élevée de magnétosomes. L’ajout de seulement de l’extrait de levure et du polypeptone entraîne une légère production de magnétosomes. L’extrait de levure ne présente aucun effet significatif sur la production de magnétosomes, alors que le polypeptone ne fait qu’augmenter la densité cellulaire finale. La raison de l’amélioration de la production de magnétosomes par la L-cystéine est inconnue, cependant, on suppose que la production de magnétosomes n’est pas associée à des potentiels redox plus faibles en présence de L-cystéine. De plus, AMB-1 peut se développer sans acides aminés disponibles et les voies de synthèse de la L-cystéine dans AMB-1 peuvent ne pas être efficaces ou liées à la croissance cellulaire. Par conséquent, AMB-1 peut utiliser directement la L-cystéine au lieu d’avoir à la synthétiser pour faciliter la croissance cellulaire.

Ke et coll. , Magnetospirillum cultivé sp. ME-1 en milieu de croissance enrichi en acétate de sodium, succinate de sodium, extrait de levure, MgSO4, NH4Cl et citrate ferrique. ME-1 utilise une source de carbone pour la croissance telle que le succinate, le fumarate, l’oxaloacétate, le pyruvate, l’acétate, le lactate, le malate et la peptone. De plus, le ME-1 peut se développer en l’absence de source d’azote, cependant, une supplémentation en NH4Cl ou en NaNO3 améliore la croissance du ME-1. Le ME-1 présente une activité uréase et oxydase, suggérant la capacité de croissance aérobie, cependant, la condition aérobie inhibe la formation de magnétosomes dans le ME-1. La fermentation par lots nourris du ME-1 a été optimisée à un niveau constant de pH 6,8 dans un fermenteur de 10 L basé sur une alimentation pH-statique, tout en fournissant les sources de carbone, d’azote et de fer pour la production à grande échelle (tableau 1).

Malgré le rendement élevé en magnétosomes, de telles méthodes développées pour la croissance des bactéries magnétotactiques contiennent des composants toxiques dans le milieu de croissance. Ces composants comprennent des produits chimiques cancérigènes, mutagènes et reprotoxiques, des métaux lourds, des agents chélateurs et des ingrédients d’origine animale non caractérisés tels que l’extrait de levure. Il y a un grand besoin d’obtenir une production à grande échelle de magnétosomes purs avec la quantité la plus faible possible de telles impuretés ou de composants toxiques (autres métaux que le fer). Par conséquent, Berny et al. , a développé un milieu de croissance minimal pour la production de magnétosomes avec moins ou dépourvu de composants toxiques, et ayant des propriétés magnétosomiques similaires à celles obtenues dans les meilleures conditions de croissance rapportées par Zhang et al. . Tout d’abord, les bactéries magnétotactiques ont été amplifiées en milieu de pré-croissance sans produire de magnétosomes. Dans une deuxième étape, les bactéries magnétotactiques ont ensuite été alimentées avec un milieu nourri riche en fer contenant pour permettre la synthèse des magnétosomes. Après 50 h de croissance, la concentration de biomasse atteint OD565 nm = 8 et donne une production de magnétosomes d’environ 10 mg/L de milieu de croissance. Une réduction/disparition significative de la composition des magnétosomes de Zn, Mn, Ba et Al a été observée. Cette nouvelle stratégie pour la production de magnétosomes sans ou avec la plus faible concentration d’impuretés autres que le fer, ouvre la voie à des applications médicales.

Concentration en oxygène dissous

La biosynthèse des magnétosomes nécessite des conditions microaérobies ou anoxiques. Un faible niveau d’oxygène dissous affecte de manière significative la croissance cellulaire car la culture à haute densité nécessite de l’oxygène dissous élevé pour obtenir le rendement en magnétosomes souhaité. D’autre part, une augmentation de l’oxygène dissous peut augmenter la densité MSR-1 dans le milieu de culture, mais inhiber la formation de magnétosomes. Il existe donc un conflit entre la formation de magnétosomes et la croissance cellulaire, ce qui rend difficile l’atteinte simultanée d’une densité cellulaire MSR-1 élevée et d’un rendement magnétosomique élevé. Ce conflit peut être quelque peu résolu en contrôlant l’oxygène dissous à un niveau optimal grâce à l’ajustement du taux de croissance cellulaire. Jajan et coll. , a rapporté la réduction de l’absorption de fer et de la production de magnétosomes au niveau d’oxygène dissous supérieur à 5-10 ppm. Cependant, lorsque l’oxygène dissous était inférieur à 5-10 ppm, le taux d’absorption du fer et la production de magnétosomes ont été augmentés, ce qui est probablement dû à la croissance lente des bactéries. Sun et coll. , culture de masse établie de MSR-1 pour une production améliorée de magnétosomes dans un fermenteur de 42 L, avec un milieu flacon optimisé, en appliquant des conditions microaérobies strictes (concentration d’oxygène dissous proche de zéro) et en utilisant du citrate ferrique et du lactate de sodium comme sources de fer et de carbone dans le milieu. Cette stratégie a été efficace pour la culture de rendement des magnétosomes, car la croissance cellulaire a été régulée à une faible concentration d’oxygène dissous, ce qui a entraîné un rendement élevé en magnétosomes.

AMB-1 est une bactérie magnétotactique anaérobie facultative qui transfère des électrons via deux voies respiratoires. Dans des conditions de croissance aérobie, AMB-1 utilise l’oxygène comme accepteur d’électrons et ne favorise ni n’inhibe la formation de particules magnétiques. Dans une voie alternative, AMB-1 utilise le nitrate comme accepteur d’électrons et nécessite donc de faibles potentiels redox des milieux, qui sont propices à la formation de magnétosomes. Dans une étude de Yang et al. , le taux de production de magnétosomes était élevé sous une faible concentration d’oxygène dissous en phase liquide. Lorsque la concentration d’oxygène dissous en phase liquide dépasse un certain niveau (0.20 ppm), la voie respiratoire s’est déplacée vers la croissance aérobie, entraînant une réduction de la production de magnétosomes.

La concentration d’oxygène dissous est fortement affectée par le débit d’air et le taux d’agitation. Lorsque l’oxygène dissous pendant la phase de croissance initiale est augmenté en augmentant le débit d’air et les taux d’agitation, le rendement en magnétosomes reste faible jusqu’à ce que l’oxygène dissous diminue jusqu’à un niveau indétectable. Pour surmonter ce phénomène en culture MSR-1, l’oxygène dissous doit être augmenté à un niveau optimal par agitation, et les cellules doivent ensuite réduire l’oxygène dissous par la respiration, jusqu’à atteindre le niveau optimal pour la formation de magnétosomes. Une production élevée de magnétosomes a été obtenue en optimisant / ajustant le débit d’air et les taux d’agitation. Pendant la phase initiale de culture, l’oxygène dissous a été réduit en maintenant ces vitesses respectivement à 1 L min−1 et 200 tr/min min−1. Au cours de la phase de culture ultérieure, l’oxygène dissous a été augmenté en ajustant le débit d’air à 2 L min−1 à 20 h et le taux d’agitation à 300 tr / min min−1 à 28 h. Dans ces conditions, les cellules se sont développées rapidement, l’oxygène dissous est devenu indétectable à 12 h et la densité cellulaire a atteint OD565 nm = 12,3 à 36 h. Les concentrations de lactate de sodium et de citrate ferrique ont été contrôlées respectivement dans les plages 3-6 mmol L−1 et 70-110 µmol L−1 pendant le processus. Des valeurs élevées de rendement en magnétosomes (83,23 ± 5,36 mg L−1) et de productivité (55,49 mg L−1 jour−1) ont ainsi été atteintes (tableau 1).

En culture ME-1, l’oxygène dissous a été contrôlé pour améliorer la production de magnétosomes à un niveau constant de 0,5% par couplage au débit d’air et au taux d’agitation. Pendant la fermentation par lots nourris, une vitesse d’agitation (de l’ordre de 50 à 300 tr / min) a produit une grande quantité de magnétosomes à niveau constant d’oxygène dissous (0,5%). La densité cellulaire et le rendement en magnétosomes obtenus à 49 h étaient de 6,5 (OD565) et de 120 mg L−1 (poids humide). Cette stratégie a permis d’atteindre un rendement et une productivité élevés en magnétosomes, ce qui indique que ME-1 a un grand potentiel pour la production à grande échelle de magnétosomes.

De faibles niveaux d’oxygène dissous ont été établis empiriquement dans de nombreuses études, mais sans mesure continue de la concentration en oxygène dissous ni définition de son contrôle dans le milieu. Heyen et Schüler ont établi une méthode de contrôle automatique de la faible tension d’oxygène (pO2) dans le milieu de culture MSR-1 en utilisant un système de fermenteur pour le fonctionnement de l’oxystate. La tension de pO2 était corrélée à la formation de magnétite. La valeur de pO2 la plus basse enregistrée (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) était la plus favorable à la formation de magnétosomes. Les cellules cultivées dans des conditions d’oxystat ont montré un rendement en magnétite significativement plus élevé (6,3 mg L-1 jour-1) (tableau 1).

Absorption d’ions ferriques

Le fer est nécessaire comme cofacteur pour de nombreuses enzymes, en particulier celles impliquées dans les principales voies biologiques. Des mécanismes spécifiques de transport du fer dans les cellules fournissent des niveaux de fer suffisants pour une croissance optimale. Certaines bactéries produisent des chélateurs ferriques (appelés sidérophores) pour absorber le fer ferrique (Fe3+). Les bactéries magnétotactiques synthétisent des magnétosomes composés de magnétite ou de greigite après avoir trouvé des conditions microaérophiles adaptées à leur croissance. Dans MSR-1, la magnétite est le composant principal des magnétosomes, et la production de magnétosomes n’est donc pas significativement affectée par la concentration de citrate ferrique dans le milieu de culture. Jajan et coll. , a montré que le sulfate ferreux était une meilleure source de fer que le quinate ferrique et le citrate ferrique pour M. gryphiswaldense. Dans une étude d’AMB-1, Yang et al. , a utilisé divers sulfate ferreux et chélates ferriques comme sources de fer et a comparé leurs effets. La production de magnétosomes a été significativement améliorée par le gallate ferrique et le sulfate, et a également été affectée par d’autres sources de fer (quinate ferrique, malate ferrique) et par le taux d’absorption du fer.

L’ion ferrique (Fe3 +) est absorbé pendant la croissance cellulaire dynamique, et la quantité absorbée est corrélée à la formation de magnétosomes lorsque le niveau d’oxygène dissous dans le milieu est indétectable. La formation de magnétosomes nécessite une concentration micromolaire en fer et des conditions microoxiques. Les cellules MSR-1 sont non magnétiques dans des conditions oxiques, mais commencent à produire de la magnétite lorsque la concentration en oxygène dissous tombe en dessous d’une valeur seuil (20 mbar ou indétectable). Dans la phase log de la croissance cellulaire, l’ion ferrique est rapidement absorbé et son taux d’absorption est > 80% et corrélé à la formation de magnétosomes.

La synthèse des magnétosomes consomme de l’ATP

L’ATP est la source d’énergie universelle nécessaire au métabolisme, au transport moléculaire, à la transduction du signal et à d’autres processus physiologiques cellulaires cruciaux. La synthèse des magnétosomes nécessite une grande quantité d’énergie et l’absorption du fer dépend de la disponibilité de l’ATP. Le NADH fournit un gradient de protons à travers la membrane mitochondriale interne pour la production d’ATP catalysée par l’ATP synthase. Le rapport NADH/NAD+ augmente rapidement après la maturation des magnétosomes pendant la phase log.Le pouvoir réducteur

augmente considérablement pendant la synthèse des magnétosomes; cependant, un pouvoir réducteur excessif peut inhiber la synthèse des magnétosomes et la croissance cellulaire. MSR-1 peut consommer un pouvoir réducteur excessif grâce à la synthèse de polyhydroxybutyrate (PHB) et à la libération d’hydrogène. Les cellules MSR-1 contiennent des granules de PHB. L’élimination du gène de la PHB synthase dans MSR-1 a entraîné une augmentation d’environ 30% du nombre de magnétosomes. La compétition énergétique se produit donc entre le PHB et le processus de synthèse des magnétosomes. Un mutant du gène ATPase de MSR et de MSR-NPHB créé par conjugaison a été utilisé comme outil de génie génétique pour démontrer que le promoteur de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT) augmente l’expression en aval du gène ATPase. En comparaison avec MSR-1, MSR-NPHB a montré une activité d’hydrolyse supérieure de 35%, une accumulation de PHB inférieure de 71%, une consommation d’oxygène supérieure de 56% et une consommation de lactate supérieure de 40%. Le rendement maximal de MSR-NPHB dans un bioréacteur de 7,5 L était de 58,4 ± 6,4 mg L-1. Ces résultats démontrent que le rendement en magnétosomes peut être amélioré, et les coûts et le temps de production réduits, grâce à la manipulation génétique de MSR-1 en combinaison avec l’optimisation / modification des milieux de culture et de croissance.

Activité de la superoxyde dismutase

La synthèse de magnétosomes est associée à une dégradation in vitro de l’H2O2 et à des effets protecteurs contre la toxicité de l’H2O2 dans les cellules. Chez les microorganismes, l’enzyme superoxyde dismutase décompose H2O2 et le radical anion superoxyde (O2-), qui ont tous deux des effets destructeurs sur les macromolécules cellulaires. Chez les bactéries magnétotactiques, la superoxyde dismutase réduit également le stress oxydatif lors de la formation de magnétosomes. H2O2 peut former un radical hydroxyle après avoir reçu un électron du fer ferreux (Fe2+). Le radical hydroxyle est l’espèce réactive de l’oxygène (ROS) qui peut endommager les biomolécules. Yang et coll. , a démontré que lorsque suffisamment d’oxygène dissous et de nutriments sont disponibles en phase de logarithme tardive, la formation et la maturation des magnétosomes sont incapables de rattraper le taux de division cellulaire, ce qui entraîne une dilution des magnétosomes. La réduction de l’activité de la superoxyde dismutase peut donc résulter de la similitude des ROS dilués. Les magnétosomes, ainsi que les nanoparticules magnétiques artificielles, participent au piégeage des ROS, et cette activité peut également conduire à une activité réduite de la superoxyde dismutase.

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