Ravinnetasapainoinen ruokinta

tärkein magnetotaktisten bakteerien kasvuun ja siten magnetosomien muodostumiseen vaikuttava tekijä on ravinteiden, erityisesti hiililähteen, pitoisuus. MSR-1-kasvulle määritettyjä optimoituja väliolosuhteita ravistuspulloviljelmässä ei ollut mahdollista laajentaa suoraan massatuotantomittakaavan fermentoriviljelmään . MSR-1-viljelmän aikana liiallisten ravintoaineiden ja inhibitoristen komponenttien kerääntyminen väliaineeseen vaikuttaa solujen kasvuun nopeutta rajoittavasti. Liebigin Minimilain mukaan tietyn systeemin biomassaa rajoittaa tyypillisesti yhden tietyn ravintoaineen määrä, vaikka muita ravinteita olisi liikaa .

ravinnetasapainoinen ruokintastrategia voi vähentää liian suuren ravinnemäärän aiheuttamaa estovaikutusta väliaineessa. Tässä strategiassa Na+− ja Cl-ionien kertymistä vähennetään korvaamalla hiili-ja typpilähteitä. Ruokitun erän viljelmässä Na+− ja Cl-ionien kertyminen vähentää osmoottista potentiaalia ja siten estää solujen kasvua. Pienikin NaCl-pitoisuus (40 mM ) esti solujen kasvua . Ravinnetasapainoinen ruokintastrategia voi siis merkittävästi parantaa kasvunopeutta.

Liu ym. , perustettiin MSR-1-viljelyyn” chemostat culture ” – tekniikka, joka perustuu pH-stat-ruokintaan typen, hiilen ja raudan pitoisuuksien johdonmukaisuuden ylläpitämiseksi käyttämällä useita orgaanisia happoja. MSR-1-viljelyyn haettiin mikroaerobisia olosuhteita ruokitun erän autofermentor-järjestelmässä. PH-stat-ruokinnassa käytettiin ravinneliuosta, joka sisälsi (litrassa) ferrisitraattia (4,2 g), maitohappoa (52,6 g), natriumlaktaattia (129 g) ja NH4Cl: ää (54,9 g). Korkeat magnetosomin saantoarvot (83,23 ± 5,36 mg L− 1) ja solujen kasvu (55,49 mg L− 1 vrk− 1) saavutettiin alhaisella natriumlaktaattipitoisuudella (Taulukko 1). Chemostat-viljelmätekniikka edistää tehokkaasti magnetosomin saantoa ja solujen kasvua vähäisillä aika-ja energiakustannuksilla. Sytotoksisia vaikutuksia havaittiin liuenneen hapen liiallisesta pitoisuudesta (≥20 ppb) ja maitohapon esiintymisestä väliaineessa. Autofermentor-järjestelmien keinotekoiset säätelystrategiat on mukautettava solujen fysiologiseen tilaan. Samoin Fernández-Castané et al. , osoitti pH-stat fed-erän kasvustrategian. Tässä strategiassa rehuun levitettiin erilaisia maitohapon (hiililähteen) ja natriumnitraatin (elektronisenseptorin) pitoisuuksia. Kasvuolosuhteet ja solunsisäinen rautapitoisuus optimoitiin biomassapitoisuuden mukaan. Suurin biomassapitoisuus saavutti OD565 nm = 15,50 .

Taulukko 1 Magnetosomien Tuottotuotanto magnetotaaisten bakteerien avulla ja niiden olosuhteet

MSR-1-solujen kasvu ja magnetosomien muodostuminen ovat suuria, kun natriumlaktaattia käytetään hiililähteenä. Toisaalta natriumlaktaattipitoisuutta tarvitaan alhaisen liuenneen hapen pitoisuuden ylläpitämiseksi solujen nopealle kasvulle ja magnetosomin muodostumiselle . Natriumlaktaattipitoisuuden ylläpitäminen massatuotantomittakaavassa on vaikeaa, minkä vuoksi laboratoriossa tarvitaan erityisiä ruokintastrategioita. Nh4cl: n on osoitettu olevan NaNO3: A parempi typenlähde .

Zhang ym. , saavutettu maksimaalinen magnetosomin tuotto MSR-1: ssä käyttämällä puolijatkuvaa kulttuuristrategiaa. Optimoitua pullomateriaalia käytettiin 7,5-ja 42− litraisissa autofermentoreissa, ravinnetasapainoista ruokintastrategiaa sovellettiin ja hiili-ja typpilähteet korvattiin Na+ – ja Cl-ionien kertymisen vähentämiseksi. Osmoottinen potentiaali väheni Na+− ja Cl-ionien kertymisellä, jolloin magnetosomin tuotto ja solujen kasvu estyivät. Saavutimme maksimiarvot fed-erän viljelmässä magnetosomin tuotosta 356.52 mg L− 1 ja solujen kasvu 9, 16 g L− 1 (Taulukko 1).

Yang ym. , viljellyt AMB-1-solut magneettisessa spirillum-kasvualustassa (MSGM), joka on rikastettu L-kysteiinillä, hiivauutteella ja polypeptonilla. Tässä järjestelmässä L-kysteiini lisäsi solujen kasvua ja vähensi lag-vaihetta, mikä johti suureen magnetosomin tuotantoon. Pelkästään hiivauutteen ja polypeptonin lisääminen johtaa magnetosomien vähäiseen tuotantoon. Hiivauutteella ei ole merkittävää vaikutusta magnetosomin tuotannossa, kun taas polypeptoni vain lisää lopullista solutiheyttä . Syytä L-kysteiinin magnetosomien tuotannon paranemiseen ei tiedetä, mutta oletetaan, että magnetosomien tuotanto ei liity pienempiin redox-mahdollisuuksiin L-kysteiinin läsnä ollessa . Lisäksi AMB-1 voi kasvaa ilman käytettävissä olevia aminohappoja ja L-kysteiinin synteesireitit AMB-1: ssä eivät välttämättä ole tehokkaita tai liittyvät solujen kasvuun. Siksi AMB-1 voi käyttää suoraan L-kysteiiniä sen sijaan, että sitä tarvitsisi syntetisoida solujen kasvun helpottamiseksi .

Ke et al. , viljelty Magnetospirillum sp. Me-1 kasvualustassa, joka on rikastettu natriumasetaatilla, natriumsukkinaatilla, hiivauutteella, MgSO4: llä, NH4Cl: llä ja ferrisitraatilla. ME-1 käyttää hiililähdettä kasvuun, kuten sukkinaattia, fumaraattia, oksaloasetaattia, pyruvaattia, asetaattia, laktaattia, malaattia ja peptonia. Lisäksi ME-1 voi kasvaa ilman typpilähdettä, kuitenkin NH4Cl tai NaNO3-täydennys parantaa ME-1-kasvua. ME-1 esiintyy ureaasi-ja oksidaasiaktiivisuutta, mikä viittaa aerobisen kasvun kykyyn, mutta aerobinen kunto estää magnetosomin muodostumista ME-1: ssä . Me-1: n Fed-eräkäyminen optimoitiin vakiona pH 6.8: ssa 10-L: n fermentorissa, joka perustuu pH-staattiseen syöttöön, toimittaen samalla hiili -, typpi-ja rautalähteet laajamittaiseen tuotantoon (Taulukko 1).

magnetosomien suuresta tuotosta huolimatta tällaiset magnetotaktisten bakteerien kasvumenetelmät sisältävät kasvualustassa myrkyllisiä aineosia. Näitä komponentteja ovat karsinogeeniset, mutageeniset ja lisääntymismyrkylliset kemikaalit, raskasmetallit, kelatoivat aineet ja luonnehtimattomat eläinperäiset ainesosat, kuten hiivauute . On suuri tarve saada laajamittainen tuotanto puhdasta magnetosomeja mahdollisimman pieni määrä tällaisia epäpuhtauksia tai myrkyllisiä komponentteja (muita metalleja kuin rautaa). Siksi Berny et al. , kehitti minimaalisen kasvualustan magnetosomien tuotantoa varten, jossa on vähemmän tai ei lainkaan myrkyllisiä komponentteja ja joilla on samanlaiset magnetosomiominaisuudet kuin Zhang et al: n parhaissa raportoiduissa kasvuolosuhteissa. . Ensinnäkin magnetotaktisia bakteereja monistettiin esikasvualustalla tuottamatta magnetosomeja . Toisessa vaiheessa magnetotaktisia bakteereita sitten ruokittiin rautapitoisella syöttöerän sisältävällä väliaineella magnetosomin synteesin mahdollistamiseksi . 50 tunnin kasvun jälkeen biomassapitoisuus saavutti od565 nm = 8 ja tuottaa magnetosomeja noin 10 mg / L kasvualustaa. ZN: n, Mn: n, Ba: n ja Al: n magnetosomikoostumuksessa havaittiin merkittävää vähenemistä/häviämistä . Tämä uusi magnetosomien tuotantostrategia ilman muita epäpuhtauksia kuin rautaa tai alhaisimpia pitoisuuksia tasoittaa tietä lääketieteellisiin sovelluksiin.

liuenneen hapen pitoisuus

Magnetosomin biosynteesi vaatii mikroaerobisia tai anoksisia olosuhteita. Alhainen liuenneen hapen määrä vaikuttaa merkittävästi solujen kasvuun, koska tiheysviljely vaatii runsaasti liuennutta happea halutun magnetosomin tuoton saamiseksi. Toisaalta lisääntynyt liuennut happi voi lisätä MSR-1-tiheyttä viljelyaineessa, mutta estää magnetosomien muodostumista . Magnetosomien muodostumisen ja solujen kasvun välillä on siis ristiriita, mikä vaikeuttaa suuren MSR-1-kennotiheyden ja suuren magnetosomien tuoton samanaikaista saavuttamista. Tämä ristiriita voidaan ratkaista jonkin verran ohjaamalla liuennut happi optimaaliselle tasolle säätämällä solujen kasvunopeutta. Jajan ym. , raportoi vähentyneen raudan oton ja magnetosomien tuotannon liuenneen hapen tasolla yli 5-10 ppm. Kun liuennut happi oli kuitenkin alle 5-10 ppm, raudan ottonopeus ja magnetosomien tuotanto lisääntyivät, mikä johtui todennäköisesti bakteerien hitaasta kasvusta . Sun ym. , vakiintunut MSR-1: n massaviljely magnetosomin tuotannon tehostamiseksi 42-litraisessa fermentorissa optimoidulla pulloalustalla soveltamalla tiukkoja mikroaerobisia olosuhteita (liuenneen hapen pitoisuus lähes nolla) ja käyttämällä rautasitraattia ja natriumlaktaattia rauta-ja hiililähteinä väliaineessa. Tämä strategia oli tehokas magnetosomien tuottoviljelyssä, koska solujen kasvua säädeltiin alhaisella liuenneen hapen pitoisuudella, mikä johti suureen magnetosomien saantoon.

AMB-1 on fakultatiivinen anaerobinen magnetotaktinen bakteeri, joka siirtää elektroneja kahta hengitystietä pitkin. Aerobisissa kasvuolosuhteissa AMB-1 käyttää happea elektronien hyväksyjänä eikä edistä eikä estä magneettisten hiukkasten muodostumista. Vaihtoehtoisessa reitissä AMB-1 käyttää nitraattia elektronien hyväksyjänä ja vaatii siksi matalia väliaineen redox-potentiaaleja, jotka edistävät magnetosomien muodostumista. Tutkimuksessa Yang et al. , magnetosomin tuotantonopeus oli suuri alhaisessa liuenneen hapen pitoisuudessa nestefaasissa. Kun liuenneen hapen pitoisuus nestefaasissa ylitti tietyn tason (0.20 ppm), hengitystie siirtyi aerobiseen kasvuun, mikä johti magnetosomin tuotannon vähenemiseen.

liuenneen hapen pitoisuuteen vaikuttavat voimakkaasti ilmavirtaus ja sekoitusnopeus. Kun liuennutta happea nostetaan ensimmäisen kasvuvaiheen aikana lisäämällä ilmavirtausta ja sekoitusnopeuksia, magnetosomin tuotto pysyy alhaisena, kunnes liuennut happi laskee havaittavalle tasolle. Tämän ilmiön voittamiseksi MSR-1-viljelyssä liuennut happi on parannettava optimaaliselle tasolle sekoittamalla, ja solujen annetaan sitten vähentää liuennutta happea hengityksen kautta, kunnes saavutetaan optimaalinen taso magnetosomin muodostumiselle. Suuri magnetosomin tuotanto saavutettiin optimoimalla / säätämällä ilmavirtausta ja sekoitusnopeuksia . Ensimmäisen viljelmävaiheen aikana liuennutta happea vähennettiin pitämällä näitä nopeuksia vastaavasti 1 L min− 1 ja 200 rpm min− 1. Myöhemmässä viljelyvaiheessa liuennutta happea lisättiin säätämällä ilmavirtaus 2 L min− 1: een 20 tunnin kohdalla ja sekoitusnopeus 300 rpm min− 1: een 28 tunnin kohdalla. näissä olosuhteissa solut kasvoivat nopeasti, liuennutta happea ei voitu havaita 12 tunnin kohdalla ja solutiheys saavutti OD565 nm: n = 12,3 36 tunnin kohdalla. natriumlaktaatti− ja ferrisitraattipitoisuudet kontrolloitiin vastaavasti alueilla 3-6 mmol L− 1 ja 70-110 µmol l-1 prosessin aikana. Näin saavutettiin korkeat magnetosomin saantoarvot (83,23 ± 5,36 mg L− 1) ja tuottavuus (55,49 mg L− 1 day-1) (Taulukko 1).

Me-1-viljelyssä liuennutta happea kontrolloitiin magnetosomin tuotannon tehostamiseksi vakiolla 0,5% kytkemällä siihen ilmavirtaus-ja sekoitusnopeus. Fed-eräkäymisen aikana sekoitusnopeus (välillä 50-300 rpm) tuotti suuren määrän magnetosomeja liuenneen hapen tasaisella tasolla (0,5%). Tuloksena saatu kennotiheys ja magnetosomin tuotto 49 tunnin kohdalla olivat 6,5 (OD565) ja 120 mg L− 1 (märkäpaino). Tällä strategialla saavutettiin korkea magnetosomien tuotto ja tuottavuus, mikä osoittaa, että ME-1: llä on suuri potentiaali magnetosomien laajamittaiseen tuotantoon .

alhaiset liuenneen hapen pitoisuudet on todettu empiirisesti monissa tutkimuksissa, mutta ilman liuenneen hapen pitoisuuden jatkuvaa mittaamista tai sen kontrollin määrittelyä väliaineessa. Heyen ja Schüler kehittivät menetelmän MSR-1-viljelyaineen vähähappisen jännityksen (pO2) automaattiseen säätöön käyttämällä hapentorijärjestelmää oksistaattioperaatiota varten. pO2-jännitys korreloi magnetiitin muodostumisen kanssa. Pienin kirjattu pO2-arvo (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) oli suotuisin magnetosomien muodostumiselle. Oksistaattiolosuhteissa kasvatetuissa soluissa magnetiitin saanto oli huomattavasti suurempi (6,3 mg L− 1 day− 1) (Taulukko 1).

rauta-ioninotto

rautaa tarvitaan kofaktorina monille entsyymeille, erityisesti niille, jotka osallistuvat tärkeisiin biologisiin reitteihin. Solujen erityiset raudankuljetusmekanismit takaavat optimaalisen kasvun edellyttämät rautapitoisuudet. Jotkin bakteerit tuottavat ferrikelaattoreita (sideroforeja), jotka ottavat rautarautaa (Fe3+). Magnetotaktiset bakteerit syntetisoivat magnetiitista tai greigiitistä koostuvia magnetosomeja löydettyään mikroaerofiiliset olosuhteet, jotka sopivat niiden kasvulle . MSR-1: ssä magnetiitti on magnetosomien pääkomponentti, joten ferrisitraattipitoisuus viljelyaineessa ei vaikuta magnetosomien tuotantoon merkittävästi. Jajan ym. , osoitti, että ferrosulfaatti oli parempi raudan lähde kuin ferrikvinaatti ja ferrisitraatti M. gryphiswaldenselle . Tutkimuksessa AMB-1, Yang et al. , käytti rautalähteinä erilaisia ferrosulfaattia ja ferrikelaatteja ja vertasi niiden vaikutuksia. Magnetosomin tuotantoa tehostivat merkittävästi ferrigallaatti ja sulfaatti, ja siihen vaikutti myös muu rautalähde (ferrikvinaatti, ferrimalaatti) sekä raudan kertymisnopeus.

Ferri-ioni (Fe3+) otetaan solun dynaamisen kasvun aikana, ja otettu määrä korreloi magnetosomien muodostumisen kanssa, kun liuenneen hapen määrä väliaineessa on huomaamaton. Magnetosomin muodostuminen vaatii mikromolaarista rautakonsentraatiota ja mikrooksisia olosuhteita . MSR-1-solut eivät ole magneettisia oksaalisissa olosuhteissa, mutta alkavat tuottaa magnetiittia, kun liuenneen hapen pitoisuus laskee alle raja-arvon (20 mbar tai huomaamaton). Solun kasvun log-vaiheessa Ferri-ioni tarttuu nopeasti ja sen absorptionopeus on > 80% ja korreloi magnetosomien muodostumisen kanssa .

Magnetosomin synteesi kuluttaa ATP: tä

ATP on universaali energianlähde, jota tarvitaan aineenvaihduntaan, molekyylikuljetukseen, signaalinsiirtoon ja muihin ratkaiseviin solun fysiologisiin prosesseihin. Magnetosomisynteesi vaatii paljon energiaa, ja raudan Otto riippuu ATP: n saatavuudesta. NADH tuottaa sisemmän mitokondriokalvon läpi protonigradientin ATP: n tuottamiseen ATP-syntaasin katalysoimana . NADH / NAD+ – suhde kasvaa nopeasti magnetosomien kypsymisen jälkeen log-vaiheessa.

Pelkistysteho kasvaa merkittävästi magnetosomisynteesin aikana; liiallinen pelkistysteho voi kuitenkin estää magnetosomisynteesiä ja solujen kasvua . MSR-1 voi kuluttaa liikaa pelkistävää voimaa polyhydroksibutyraatin (PHB) synteesin ja vedyn vapautumisen kautta . MSR-1-solut sisältävät PHB-rakeita . PHB-syntaasigeenin tyrmäys MSR-1: ssä johti magnetosomiluvun kasvuun ~ 30%. Näin PHB: n ja magnetosomin synteesiprosessin välillä esiintyy energiakilpailua. Konjugaatiossa syntynyttä MSR: n ja MSR-NPHB: n atpaasigeenin mutanttia käytettiin geenitekniikan välineenä osoittamaan, että kloramfenikoliasetyylitransferaasin (CAT) promoottori lisää atpaasigeenin loppupään ilmentymistä. MSR-1: een verrattuna MSR-NPHB osoitti 35% suurempaa hydrolyysiaktiivisuutta, 71% pienempää PHB: n kertymistä, 56% suurempaa hapenkulutusta ja 40% suurempaa laktaatin kulutusta. MSR-NPHB: n suurin saanto 7,5-litraisessa bioreaktorissa oli 58,4 ± 6,4 mg L− 1 . Nämä havainnot osoittavat, että MAGNETOSOMIN saantoa voidaan parantaa ja tuotantokustannuksia ja-aikaa vähentää MSR-1: n geenimanipulaatiolla yhdessä viljelyn ja kasvualustan optimoinnin/ muokkaamisen kanssa.

superoksididismutaasin aktiivisuus

Magnetosomin synteesi liittyy H2O2: n hajoamiseen in vitro ja suojaaviin vaikutuksiin H2O2: n toksisuutta vastaan soluissa. Mikro-organismeissa superoksididismutaasientsyymi hajottaa H2O2− ja superoksidianioniradikaalin (O2 -), joilla molemmilla on tuhoisia vaikutuksia solujen makromolekyyleihin . Magnetotaktisissa bakteereissa superoksididismutaasi vähentää myös oksidatiivista stressiä magnetosomin muodostumisen aikana. H2O2 voi muodostaa hydroksyyliradikaalin saatuaan elektronin rautaraudalta (Fe2+). Hydroksyyliradikaali on reaktiivinen happilaji (ROS), joka voi vahingoittaa biomolekyylejä . Yang ym. , on osoitettu, että kun liuennutta happea ja ravinteita on riittävästi saatavilla myöhäisessä log-vaiheessa, magnetosomien muodostuminen ja kypsyminen eivät pysty saavuttamaan solujen jakautumisnopeutta, mikä johtaa magnetosomien laimentumiseen. Superoksididismutaasin aktiivisuuden väheneminen voi siis johtua laimennetun ROS: n samankaltaisuudesta. Magnetosomit, kuten myös keinotekoiset magneettiset nanohiukkaset, osallistuvat ROS: n raadantaan , ja tämä aktiivisuus voi johtaa myös superoksididismutaasiaktiivisuuden vähenemiseen.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.