Nährstoffbalancierte Fütterung

Der Hauptfaktor, der das Wachstum von magnetotaktischen Bakterien und folglich die Bildung von Magnetosomen beeinflusst, ist die Konzentration von Nährstoffen, insbesondere der Kohlenstoffquelle. Es war nicht möglich, die für das MSR-1-Wachstum in Schüttelkolbenkultur ermittelten optimierten Mediumsbedingungen direkt auf die Fermenterkultur im Massenmaßstab auszudehnen. Während der MSR-1-Kultur übt die Akkumulation von übermäßigen Nährstoffen und inhibitorischen Komponenten im Medium geschwindigkeitsbegrenzende Effekte auf das Zellwachstum aus. Nach dem Liebigschen Minimalgesetz ist die Biomasse in einem gegebenen System typischerweise durch die Menge eines bestimmten Nährstoffs begrenzt, selbst wenn andere Nährstoffe im Überschuss vorhanden sind .

Eine nährstoffbalancierte Fütterungsstrategie kann die hemmende Wirkung einer übermäßigen Nährstoffmenge im Medium verringern. Bei dieser Strategie wird die Akkumulation von Na + − und Cl- -Ionen durch den Ersatz von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen reduziert. In der Fed-Batch−Kultur verringert die Akkumulation von Na + – und Cl- – Ionen das osmotische Potential und hemmt folglich das Zellwachstum. Schon eine niedrige NaCl-Konzentration (40 mM) hemmte das Zellwachstum. Somit kann eine nährstoffbalancierte Fütterungsstrategie die Wachstumsrate erheblich steigern.

Liu et al. , etablierte eine „Chemostat-Kultur“ -Technik für die MSR-1-Kultivierung basierend auf pH-Stat-Fütterung, um die Konsistenz der Stickstoff-, Kohlenstoff- und Eisenkonzentrationen unter Verwendung mehrerer organischer Säuren aufrechtzuerhalten. Für die MSR-1-Kultivierung wurden mikroaerobe Bedingungen in einem Fed-Batch-Autofermentorsystem angewendet. Zur pH-Stat-Fütterung wurde eine Nährlösung verwendet, die (pro Liter) Eisencitrat (4,2 g), Milchsäure (52,6 g), Natriumlactat (129 g) und NH4Cl (54,9 g) enthielt. Hohe Werte der Magnetosomenausbeute (83,23 ± 5,36 mg L− 1) und des Zellwachstums (55,49 mg L− 1 Tag− 1) wurden bei niedrigem Natriumlactatspiegel erreicht (Tabelle 1). Die Chemostat-Kulturtechnik fördert effizient die Magnetosomenausbeute und das Zellwachstum bei geringen Zeit- und Energiekosten. Zytotoxische Wirkungen wurden bei übermäßiger Konzentration von gelöstem Sauerstoff (≥ 20 ppb) und Vorhandensein von Milchsäure im Medium beobachtet. Künstliche Kontrollstrategien für Autofermentorsysteme müssen im Hinblick auf den physiologischen Zustand der Zellen angepasst werden. In ähnlicher Weise haben Fernández-Castané et al. , demonstrierte die pH-stat Fed-Batch-Wachstumsstrategie. Bei dieser Strategie wurden verschiedene Konzentrationen der Milchsäure (Kohlenstoffquelle) und Natriumnitrat (Elektronenakzeptor) im Feed aufgebracht. Die Wachstumsbedingungen und die intrazelluläre Eisenkonzentration wurden entsprechend der Biomassekonzentration optimiert. Die höchste Biomassekonzentration erreichte OD565 nm = 15,50.

Tabelle 1: Herstellung von Magnetosomen durch magnetotaische Bakterien und deren Bedingungen

MSR-1-Zellwachstum und Magnetosomenbildung sind hoch, wenn Natriumlactat als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Andererseits ist eine niedrige Natriumlactatkonzentration erforderlich, um eine niedrige Konzentration an gelöstem Sauerstoff für ein schnelles Zellwachstum und eine Magnetosomenbildung aufrechtzuerhalten . Die Aufrechterhaltung der Natriumlactatkonzentration in der Massenproduktion ist schwierig, und daher sind im Labor spezifische Fütterungsstrategien erforderlich. NH4Cl ist gezeigt worden, um eine bessere Stickstoffquelle als NaNO3 zu sein.

Zhang et al. , erreichte maximale Magnetosomenausbeute in MSR-1 unter Verwendung einer halbkontinuierlichen Kulturstrategie. Optimiertes Kolbenmedium wurde in 7,5- und 42-L-Autofermentoren verwendet, eine nährstoffbalancierte Fütterungsstrategie wurde angewendet und Kohlenstoff− und Stickstoffquellen wurden ersetzt, um die Akkumulation von Na + – und Cl-Ionen zu reduzieren. Das osmotische Potential wurde durch die Akkumulation von Na + und Cl− Ionen verringert, wodurch die Magnetosomenausbeute und das Zellwachstum gehemmt wurden. Wir erreichten maximale Werte in Fed-Batch-Kultur von Magnetosomenausbeute 356.52 mg L− 1 und Zellwachstum 9,16 g L- 1 (Tabelle 1).

Yang et al. , kultivierte AMB-1-Zellen in magnetischem Spirillum-Wachstumsmedium (MSGM), angereichert mit L-Cystein, Hefeextrakt und Polypepton. In diesem System verbesserte L-Cystein das Zellwachstum und reduzierte die Verzögerungsphase, was zu einer hohen Magnetosomenproduktion führte. Die Zugabe von nur Hefeextrakt und Polypepton führt zur Produktion von Magnetosomen. Hefeextrakt zeigt keinen signifikanten Effekt bei der Magnetosomenproduktion, während Polypepton nur die endgültige Zelldichte erhöht . Der Grund für die verbesserte Produktion von Magnetosomen durch L-Cystein ist unbekannt, es wird jedoch angenommen, dass die Magnetosomenproduktion nicht mit niedrigeren Redoxpotentialen in Gegenwart von L-Cystein verbunden ist. Darüber hinaus kann AMB-1 ohne verfügbare Aminosäuren wachsen, und die L-Cystein-Synthesewege in AMB-1 sind möglicherweise nicht effizient oder hängen mit dem Zellwachstum zusammen. Daher kann AMB-1 L-Cystein direkt verwenden, anstatt es zur Erleichterung des Zellwachstums synthetisieren zu müssen .

Ke et al. , kultiviertes Magnetospirillum sp. ME-1 in Wachstumsmedium angereichert mit Natriumacetat, Natriumsuccinat, Hefeextrakt, MgSO4, NH4Cl und Eisencitrat. ME-1 nutzt Kohlenstoffquelle für das Wachstum wie Succinat, Fumarat, Oxalacetat, Pyruvat, Acetat, Lactat, Malat und Pepton. Darüber hinaus kann ME-1 in Abwesenheit einer Stickstoffquelle wachsen, NH4Cl- oder NaNO3-Supplementierung verbessert jedoch das ME-1-Wachstum. ME-1 zeigen Urease- und Oxidaseaktivität, was auf die Fähigkeit des aeroben Wachstums hindeutet, jedoch hemmt der aerobe Zustand die Magnetosomenbildung in ME-1 . Die Fed-Batch-Fermentation von ME-1 wurde bei einem konstanten pH-Wert von 6,8 in einem 10-L-Fermenter basierend auf pH-statischer Fütterung optimiert, während die Kohlenstoff-, Stickstoff- und Eisenquellen für die Großproduktion bereitgestellt wurden (Tabelle 1).

Trotz der hohen Ausbeute an Magnetosomen enthalten solche entwickelten Methoden zum Wachstum von magnetotaktischen Bakterien toxische Komponenten im Wachstumsmedium. Zu diesen Komponenten gehören krebserzeugende, erbgutverändernde und fortpflanzungsgefährdende Chemikalien, Schwermetalle, Chelatbildner und nicht charakterisierte tierische Inhaltsstoffe wie Hefeextrakt . Es besteht ein großer Bedarf, in großem Maßstab reine Magnetosomen mit möglichst geringen Verunreinigungen oder toxischen Bestandteilen (andere Metalle als Eisen) herzustellen. Daher haben Berny et al. , entwickelte ein minimales Wachstumsmedium für die Magnetosomenproduktion mit weniger oder ohne toxische Komponenten, und mit ähnlichen Magnetosomeneigenschaften wie diejenigen, die unter den besten berichteten Wachstumsbedingungen von Zhang et al. . Erstens wurden magnetotaktische Bakterien in Präwachstumsmedium amplifiziert, ohne Magnetosomen zu produzieren . Im zweiten Schritt wurden magnetotaktische Bakterien dann mit einem eisenreichen Fed-Batch-Medium gefüttert, das die Magnetosomensynthese ermöglichte. Nach 50 h Wachstum erreichte die Biomassekonzentration OD565 nm = 8 und ergab eine Magnetosomenproduktion von etwa 10 mg / L Wachstumsmedium. Es wurde eine signifikante Reduktion / Verschwinden der Magnetosomenzusammensetzung von Zn, Mn, Ba und Al beobachtet . Diese neue Strategie zur Herstellung von Magnetosomen ohne oder mit geringster Konzentration anderer Verunreinigungen als Eisen ebnet den Weg für medizinische Anwendungen.

Konzentration von gelöstem Sauerstoff

Die Magnetosomenbiosynthese erfordert mikroaerobe oder anoxische Bedingungen. Ein niedriger Gehalt an gelöstem Sauerstoff beeinflusst das Zellwachstum erheblich, da eine Kultur mit hoher Dichte einen hohen Gehalt an gelöstem Sauerstoff erfordert, um die gewünschte Magnetosomenausbeute zu erzielen. Andererseits kann erhöhter gelöster Sauerstoff die MSR-1-Dichte im Kulturmedium erhöhen, aber die Magnetosomenbildung hemmen . Es besteht somit ein Konflikt zwischen Magnetosomenbildung und Zellwachstum, wodurch es schwierig wird, gleichzeitig eine hohe MSR-1-Zelldichte und eine hohe Magnetosomenausbeute zu erreichen. Dieser Konflikt kann etwas gelöst werden, indem gelöster Sauerstoff durch Anpassung der Zellwachstumsrate auf ein optimales Niveau gebracht wird. Jajan et al. , berichtete über die verringerte Eisenaufnahme und Magnetosomenproduktion am Niveau des aufgelösten Sauerstoffs von über 5-10 ppms. Wenn jedoch gelöster Sauerstoff niedriger als 5-10 ppm war, wurde die Eisenaufnahmerate und die Produktion von Magnetosomen erhöht, was wahrscheinlich auf das langsame Wachstum von Bakterien zurückzuführen ist . In: Sun et al. , etablierte Massenkultur von MSR-1 für eine verbesserte Magnetosomenproduktion in einem 42-L-Fermenter mit optimiertem Kolbenmedium unter Anwendung strenger mikroaerober Bedingungen (Konzentration von gelöstem Sauerstoff nahe Null) und unter Verwendung von Eisencitrat und Natriumlactat als Eisen- und Kohlenstoffquellen im Medium. Diese Strategie war für die Ertragskultivierung von Magnetosomen effektiv, da das Zellwachstum bei niedriger Konzentration an gelöstem Sauerstoff reguliert wurde, was zu einer hohen Magnetosomenausbeute führte.

AMB-1 ist ein fakultatives anaerobes magnetotaktisches Bakterium, das Elektronen über zwei Atmungswege überträgt. Unter aeroben Wachstumsbedingungen nutzt AMB-1 Sauerstoff als Elektronenakzeptor und weder fördert noch hemmt die Bildung von magnetischen Partikeln. In einem alternativen Weg verwendet AMB-1 Nitrat als Elektronenakzeptor und erfordert daher niedrige Medienredoxpotentiale, die der Magnetosomenbildung förderlich sind. In einer Studie von Yang et al. , Magnetosomenproduktionsrate war unter niedriger Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Flüssigphase hoch. Wenn gelösten sauerstoff konzentration in flüssiger phase überschritten eine bestimmte ebene (0.20 ppm) verlagerte sich der Atmungsweg zum aeroben Wachstum, was zu einer verringerten Magnetosomenproduktion führte.

Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wird stark von der Luftströmungsrate und der Rührrate beeinflusst. Wenn gelöster Sauerstoff während der anfänglichen Wachstumsphase durch Erhöhung des Luftstroms und der Rührraten erhöht wird, Die Magnetosomenausbeute bleibt niedrig, bis der gelöste Sauerstoff auf ein nicht nachweisbares Niveau abfällt. Um dieses Phänomen bei der MSR-1-Kultivierung zu überwinden, muss gelöster Sauerstoff durch Rühren auf ein optimales Niveau gebracht werden, und die Zellen können dann gelösten Sauerstoff durch Atmung reduzieren, bis das für die Magnetosomenbildung optimale Niveau erreicht ist. Eine hohe Magnetosomenproduktion wurde durch Optimierung / Anpassung des Luftstroms und der Rührraten erreicht. Während der anfänglichen Kulturphase wurde gelöster Sauerstoff reduziert, indem diese Raten jeweils bei 1 L min− 1 und 200 U / min min− 1 gehalten wurden. Während der späteren Kulturphase wurde der gelöste Sauerstoff durch Einstellen der Luftströmungsrate auf 2 L min− 1 bei 20 h und der Rührrate auf 300 U / min min− 1 bei 28 h erhöht. Unter diesen Bedingungen wuchsen die Zellen schnell, gelöster Sauerstoff wurde bei 12 h nicht nachweisbar und die Zelldichte erreichte OD565 nm = 12,3 bei 36 h. Die Natriumlactat− und Eisencitratkonzentrationen wurden während des Prozesses jeweils in den Bereichen 3-6 mmol L− 1 und 70-110 µmol L- 1 gesteuert. So wurden hohe Werte der Magnetosomenausbeute (83,23 ± 5,36 mg L− 1) und Produktivität (55,49 mg L− 1 Tag− 1) erreicht (Tabelle 1).

In der ME-1-Kultivierung wurde gelöster Sauerstoff kontrolliert, um die Magnetosomenproduktion auf einem konstanten Niveau von 0,5% durch Kopplung an die Luftströmungsrate und die Rührrate zu erhöhen. Während der Fed-Batch-Fermentation erzeugte eine Rührrate (im Bereich von 50-300 U / min) eine große Menge Magnetosomen bei konstantem Gehalt an gelöstem Sauerstoff (0,5%). Die resultierende Zelldichte und Magnetosomenausbeute bei 49 h betrug 6,5 (OD565) und 120 mg L−1 (Nassgewicht). Diese Strategie erreichte eine hohe Magnetosomenausbeute und Produktivität, was darauf hindeutet, dass ME-1 ein großes Potenzial für die großtechnische Produktion von Magnetosomen hat .

Niedrige gelöste Sauerstoffgehalte wurden in vielen Studien empirisch festgestellt, jedoch ohne kontinuierliche Messung der gelösten Sauerstoffkonzentration oder Definition ihrer Kontrolle im Medium. Heyen und Schüler entwickelten ein Verfahren zur automatischen Steuerung der niedrigen Sauerstoffspannung (pO2) in MSR-1-Kulturmedium unter Verwendung eines Fermentatorsystems für den Oxystat-Betrieb. Die PO2-Spannung korrelierte mit der Magnetitbildung. Der niedrigste gemessene pO2-Wert (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) war für die Magnetosomenbildung am günstigsten. Zellen, die unter Oxystatbedingungen gezüchtet wurden, zeigten eine signifikant höhere Magnetitausbeute (6,3 mg L− 1 Tag− 1) (Tabelle 1).

Eisenionenaufnahme

Eisen wird als Cofaktor für viele Enzyme benötigt, insbesondere für solche, die an wichtigen biologischen Signalwegen beteiligt sind. Spezifische Eisentransportmechanismen in Zellen liefern Eisenspiegel, die für ein optimales Wachstum ausreichen. Einige Bakterien produzieren Eisenchelatoren (als Siderophore bezeichnet), um Eisen (Fe3 +) aufzunehmen. Magnetotaktische Bakterien synthetisieren Magnetosomen aus Magnetit oder Greigit, nachdem sie mikroaerophile Bedingungen gefunden haben, die für ihr Wachstum geeignet sind . In MSR-1 ist Magnetit der Hauptbestandteil von Magnetosomen, und die Magnetosomenproduktion wird daher durch die Eisencitratkonzentration im Kulturmedium nicht signifikant beeinflusst. Jajan et al. , zeigte, dass Eisensulfat eine bessere Eisenquelle als Eisenquinat und Eisencitrat für M. gryphiswaldense war . In einer Studie von AMB-1, Yang et al. , verwendete verschiedene Eisensulfat- und Eisenchelate als Eisenquellen und verglich ihre Effekte. Die Magnetosomenproduktion wurde durch Eisengallat und Sulfat signifikant erhöht und auch durch andere Eisenquellen (Eisenquinat, Eisenmalat) und durch die Eisenaufnahmerate beeinflusst.

Eisen (III) -Ionen (Fe3+) wird während des dynamischen Zellwachstums aufgenommen, und die aufgenommene Menge korreliert mit der Magnetosomenbildung, wenn der Gehalt an gelöstem Sauerstoff im Medium nicht nachweisbar ist. Magnetosomenbildung erfordert mikromolare Eisenkonzentration und mikrooxische Bedingungen . MSR-1-Zellen sind unter oxischen Bedingungen nicht magnetisch, beginnen jedoch, Magnetit zu produzieren, wenn die Konzentration des gelösten Sauerstoffs unter einen Schwellenwert (20 mbar oder nicht nachweisbar) fällt. In dieser Phase des Zellwachstums wird Eisen (III) -Ionen schnell aufgenommen, und seine Absorptionsrate beträgt > 80% und korreliert mit der Magnetosomenbildung .

Die Magnetosomensynthese verbraucht ATP

ATP ist die universelle Energiequelle, die für den Stoffwechsel, den molekularen Transport, die Signaltransduktion und andere wichtige zellphysiologische Prozesse benötigt wird. Die Magnetosomensynthese erfordert eine große Menge an Energie, und die Eisenaufnahme hängt von der Verfügbarkeit von ATP ab. NADH liefert einen Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran für die ATP-Produktion, die durch ATP-Synthase katalysiert wird. Das NADH / NAD + -Verhältnis steigt nach der Magnetosomenreifung während der Log-Phase schnell an.

Die Reduktionsleistung nimmt während der Magnetosomensynthese signifikant zu; Eine übermäßige Reduktionsleistung kann jedoch die Magnetosomensynthese und das Zellwachstum hemmen . MSR-1 kann übermäßige Reduktionsleistung durch Polyhydroxybutyrat (PHB) -Synthese und Wasserstofffreisetzung verbrauchen. MSR-1-Zellen enthalten PHB-Granulate . Knockout des PHB-Synthase-Gens in MSR-1 führte zu ~ 30% Erhöhung der Magnetosomenzahl . Energiekonkurrenz tritt somit zwischen PHB und dem Magnetosomensyntheseprozess auf. Eine durch Konjugation erzeugte Mutante des ATPase-Gens von MSR und MSR-NPHB wurde als gentechnisches Werkzeug verwendet, um zu demonstrieren, dass der Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) -Promotor die nachgeschaltete Expression des ATPase-Gens erhöht. Im Vergleich zu MSR-1 zeigte MSR-NPHB eine um 35% höhere Hydrolyseaktivität, eine um 71% geringere PHB-Akkumulation, einen um 56% höheren Sauerstoffverbrauch und einen um 40% höheren Laktatverbrauch. Die maximale Ausbeute an MSR-NPHB in einem 7,5-L-Bioreaktor betrug 58,4 ± 6,4 mg L- 1 . Diese Ergebnisse zeigen, dass die Magnetosomenausbeute durch genetische Manipulation von MSR-1 in Kombination mit Optimierung / Modifikation von Kultur und Wachstumsmedien verbessert und Produktionskosten und -zeiten reduziert werden können.

Superoxiddismutaseaktivität

Die Magnetosomensynthese ist mit dem In-vitro-Abbau von H2O2 und mit schützenden Wirkungen gegen H2O2-Toxizität in Zellen verbunden. In Mikroorganismen baut das Enzym Superoxiddismutase H2O2 und Superoxidanionenradikal (O2-) ab, die beide zerstörerische Wirkungen auf Zellmakromoleküle haben . In magnetotaktischen Bakterien reduziert Superoxiddismutase auch oxidativen Stress während der Magnetosomenbildung. H2O2 kann nach Erhalt eines Elektrons aus Eisen (Fe) ein Hydroxylradikal bilden2 +). Hydroxylradikal ist die reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die Biomoleküle schädigen kann . Yang et al. , gezeigt, dass, wenn genügend gelöster Sauerstoff und Nährstoffe in der späten Log-Phase verfügbar sind, Magnetosomenbildung und -reifung nicht in der Lage sind, die Zellteilungsrate einzuholen, was zu einer Verdünnung der Magnetosomen führt. Eine Verringerung der Superoxiddismutaseaktivität kann daher aus der Verwendung von verdünntem ROS resultieren. Magnetosomen sowie künstliche magnetische Nanopartikel sind am Abfangen von ROS beteiligt , und diese Aktivität kann auch zu einer verringerten Superoxiddismutaseaktivität führen.

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