Næringsbalanceret fodring

den vigtigste faktor, der påvirker væksten af magnetotaktiske bakterier og følgelig magnetosomdannelse, er koncentration af næringsstoffer, især kulstofkilde. Det var ikke muligt at udvide optimerede medium betingelser bestemt for MSR-1 vækst i ryste-kolbe kultur direkte til masseproduktion skala fermentor kultur . Under MSR-1-kultur udøver akkumulering af overdrevne næringsstoffer og hæmmende komponenter i medium hastighedsbegrænsende virkninger på cellevækst. Ifølge Liebigs lov om Minimum er biomasse i et givet system typisk begrænset af mængden af et bestemt næringsstof, selv når andre næringsstoffer er til stede i overskud .

en næringsbalanceret fodringsstrategi kan reducere den hæmmende virkning af overdreven mængde næringsstoffer i medium. I denne strategi reduceres akkumuleringen af Na+ og Cl− ioner Ved udskiftning af kulstof-og nitrogenkilder. I fed-batch− kultur reducerer akkumulering af Na+ og Cl-ioner osmotisk potentiale og hæmmer følgelig cellevækst. Selv en lav NaCl-koncentration (40 mM ) hæmmede cellevækst . Således kan en næringsbalanceret fodringsstrategi betydeligt forbedre vækstraten.

Liu et al. , etableret en” kemostatkultur ” -teknik til MSR-1-dyrkning baseret på ph-stat-fodring for at opretholde konsistens af nitrogen -, kulstof-og jernkoncentrationer ved hjælp af flere organiske syrer. Mikroaerobe betingelser blev anvendt til MSR-1 dyrkning i et fed-batch autofermentor system. Liter ferricitrat (4,2 g), mælkesyre (52,6 g), natriumlactat (129 g) og NH4Cl (54,9 g) blev anvendt til pH-stat-fodring. Høje værdier af magnetosomudbytte (83,23 liter 5,36 mg L− 1) og cellevækst (55,49 mg L− 1 dag− 1) blev opnået ved lavt natriumlactatniveau (tabel 1). Chemostat kultur teknik effektivt fremmer magnetosome udbytte og cellevækst med lav tid og energi omkostninger. Cytotoksiske virkninger blev observeret for overdreven opløst iltkoncentration (lut20 ppb) og tilstedeværelse af mælkesyre i medium. Kunstige kontrolstrategier for autofermentorsystemer skal justeres med hensyn til cellernes fysiologiske tilstand. Tilsvarende, Fern Berg-Castan Berg et al. , demonstrerede ph-stat fed-batch vækststrategi. I denne strategi blev der anvendt forskellige koncentrationer af mælkesyre (carbonkilde) og natriumnitrat (elektronacceptor) i foderet. Vækstbetingelser og intracellulær jernkoncentration blev optimeret i henhold til biomassekoncentrationen. Den højeste biomassekoncentration nåede til OD565 nm = 15,50 .

tabel 1 udbytte produktion af magnetosomer af magnetotaiske bakterier og deres betingelser

MSR-1 cellevækst og magnetosomdannelse er høj, når natriumlactat anvendes som kulstofkilde. På den anden side er lav natriumlactatkoncentration nødvendig for at opretholde lav opløst iltkoncentration til hurtig cellevækst og magnetosomdannelse . Det er vanskeligt at opretholde natriumlactatkoncentration i masseproduktionsskalering, og der kræves derfor specifikke fodringsstrategier i laboratoriet. NH4Cl har vist sig at være en bedre nitrogenkilde end NaNO3 .

Jang et al. , opnået maksimalt magnetosomudbytte i MSR-1 ved hjælp af en semi-kontinuerlig kulturstrategi. Optimeret kolbe medium blev anvendt i 7,5-og 42− L autofermentorer, næringsbalanceret fodringsstrategi blev anvendt, og kulstof-og nitrogenkilder blev udskiftet for at reducere akkumulering af Na+ og Cl-ioner. Osmotisk potentiale blev reduceret ved Na+ og CL− ion akkumulering, hvilket hæmmer magnetosomudbytte og cellevækst. Vi opnåede maksimale værdier i fed-batch kultur af magnetosomudbytte 356.52 mg L− 1 og cellevækst 9,16 g L− 1 (Tabel 1).

Yang et al. , dyrkede AMB – 1 celler i magnetisk spirillum vækstmedium (MSGM) beriget med L-cystein, gærekstrakt og polypepton. I dette system forbedrede L-cystein cellevækst og reduceret lagfase, hvilket resulterede i høj magnetosomproduktion. Tilsætningen af kun gærekstrakt og polypepton resulterer i en lille produktion af magnetosomer. Gærekstrakt viser ingen signifikant effekt i magnetosomproduktion, hvorimod polypepton kun øger den endelige celletæthed . Årsagen til forbedret produktion af magnetosomer med L-cystein er ukendt, men det antages, at magnetosomproduktion ikke er forbundet med lavere redokspotentialer i nærvær af L-cystein . Desuden kan AMB-1 vokse uden tilgængelige aminosyrer, og L-cysteinsynteseveje i AMB-1 er muligvis ikke effektive eller relateret til cellevækst. Derfor kan AMB-1 direkte bruge L-cystein i stedet for at skulle syntetisere det for at lette cellevækst .

Ke et al. , kultiveret Magnetospirillum sp. ME – 1 i vækstmedium beriget med natriumacetat, natriumsuccinat, gærekstrakt, MgSO4, NH4Cl og ferricitrat. ME – 1 bruger kulstofkilde til vækst, såsom succinat, fumarat, pyruvat, acetat, lactat, malat og pepton. Derudover kan ME-1 vokse i fravær af nitrogenkilde, men NH4Cl-eller NaNO3-tilskud forbedrer ME-1-væksten. ME – 1 udviser urease-og oksidaseaktivitet, hvilket antyder evnen til aerob vækst, men aerob tilstand hæmmer magnetosomdannelsen i ME-1 . Fed-batch-fermentering af ME-1 blev optimeret ved et konstant niveau af pH 6,8 i en 10-L fermenter baseret på pH-statisk fodring, mens den leverede kulstof -, nitrogen-og jernkilder til storskala produktion (tabel 1).

på trods af det høje udbytte af magnetosomer indeholder sådanne udviklede metoder til vækst af magnetotaktiske bakterier giftige komponenter i vækstmedium. Disse komponenter inkluderer kræftfremkaldende, mutagene og reproduktionstoksiske kemikalier, tungmetaller, chelateringsmidler og ikke-karakteriserede animalske afledte ingredienser såsom gærekstrakt . Der er et stort behov for at opnå storskala produktion af rene magnetosomer med lavest mulig mængde af sådanne urenheder eller giftige komponenter (andre metaller end jern). Derfor, Berny et al. , udviklet et minimalt vækstmedium til produktion af magnetosomer med mindre eller blottet for giftige komponenter, og har lignende magnetosomegenskaber som dem, der opnås under de bedst rapporterede vækstbetingelser af Jang et al. . For det første blev magnetotaktiske bakterier forstærket i prævækstmedium uden at producere magnetosomer . I andet trin blev magnetotaktiske bakterier derefter fodret med et jernrigt fodret batchmedium indeholdende for at tillade magnetosomsyntese . Efter 50 timers vækst, biomasse koncentration nået til OD565 nm = 8 og udbytte magnetosomer produktion på omkring 10 mg/L vækstmedium. Der blev observeret en signifikant reduktion/forsvinden i magnetosomsammensætningen af NN, mn, Ba og Al . Denne nye strategi for magnetosomer produktion uden eller laveste koncentration af andre urenheder end jern, baner vejen mod medicinske anvendelser.

opløst iltkoncentration

Magnetosombiosyntese kræver mikroaerobe eller anoksiske tilstande. Lavt opløst iltniveau påvirker signifikant cellevækst, fordi kultur med høj densitet kræver højt opløst ilt for at opnå det ønskede magnetosomudbytte. På den anden side kan øget opløst ilt øge MSR-1-densitet i dyrkningsmedium, men hæmme magnetosomdannelse . Der eksisterer således en konflikt mellem magnetosomdannelse og cellevækst, hvilket gør det vanskeligt samtidig at opnå høj MSR-1 celletæthed og højt magnetosomudbytte. Denne konflikt kan løses noget ved at kontrollere opløst ilt til et optimalt niveau gennem justering af cellevæksthastighed. Jajan et al. , rapporterede den reducerede jernoptagelse og magnetosomerproduktion ved det opløste iltniveau på over 5-10 ppm. Men når opløst ilt var lavere end 5-10 ppm, blev jernoptagelseshastigheden og produktionen af magnetosomer øget, hvilket sandsynligvis skyldes den langsomme vækst af bakterier . Sun et al. , etableret massekultur af MSR-1 til forbedret magnetosomproduktion i en 42-L fermentor med optimeret kolbe medium ved at anvende strenge mikroaerobe betingelser (næsten nul opløst iltkoncentration) og ved hjælp af jerncitrat og natriumlactat som jern-og carbonkilder i medium. Denne strategi var effektiv til udbyttedyrkning af magnetosomer, fordi cellevækst blev reguleret ved lav opløst iltkoncentration, hvilket resulterede i højt magnetosomudbytte.

AMB-1 er en fakultativ anaerob magnetotaktisk bakterie, der overfører elektroner via to åndedrætsveje. Under aerobe vækstbetingelser bruger AMB-1 ilt som elektronacceptor og hverken fremmer eller hæmmer dannelsen af magnetiske partikler. I en alternativ vej bruger AMB-1 nitrat som elektronacceptor og kræver derfor lavmedierredoksepotentialer, som er befordrende for magnetosomdannelse. I en undersøgelse foretaget af Yang et al. , magnetosomproduktionshastigheden var høj under lav opløst iltkoncentration i flydende fase. Når opløst iltkoncentration i flydende fase oversteg et vist niveau (0.20 ppm) skiftede åndedrætsvejen til aerob vækst, hvilket førte til reduceret magnetosomproduktion.

opløst iltkoncentration påvirkes stærkt af luftstrømningshastighed og omrøringshastighed. Når opløst ilt i den indledende vækstfase hæves ved at øge luftstrømmen og omrøringshastighederne, forbliver magnetosomudbyttet lavt, indtil opløst ilt falder til et uopdageligt niveau. For at overvinde dette fænomen i MSR-1-dyrkning skal opløst ilt forbedres til et optimalt niveau ved omrøring, og celler får derefter lov til at reducere opløst ilt gennem respiration, indtil de når det niveau, der er optimalt til magnetosomdannelse. Høj magnetosomproduktion blev opnået ved at optimere/ justere luftstrømmen og omrøringshastighederne . I den indledende kulturfase blev opløst ilt reduceret ved at opretholde disse hastigheder henholdsvis ved 1 L min-1 og 200 o / min min− 1. Under senere kulturfase blev opløst ilt forøget ved at justere luftstrømningshastigheden til 2 L min− 1 ved 20 h og omrøringshastighed til 300 o / min− 1 ved 28 h. under disse betingelser voksede cellerne hurtigt, opløst ilt blev ikke detekterbart ved 12 h, og celletætheden nåede OD565 nm = 12,3 ved 36 h. natriumlactat− og ferricitratkoncentrationer blev kontrolleret henholdsvis i områderne 3-6 mmol L− 1 og 70-110 lutmol L-1 under processen. Høje værdier af magnetosomudbytte (83,23 liter 5,36 mg L− 1) og produktivitet (55,49 mg L− 1 dag− 1) blev således opnået (tabel 1).

i ME-1-dyrkning blev opløst ilt kontrolleret for at forbedre magnetosomproduktionen ved et konstant niveau på 0,5% ved kobling til luftstrømningshastigheden og omrøringshastigheden. Under fermentering med fodret batch producerede en omrøringshastighed (i området 50-300 o / min) en stor mængde magnetosomer ved konstant niveau af opløst ilt (0,5%). Den resulterende celletæthed og magnetosomudbytte ved 49 timer var 6,5 (OD565) og 120 mg L− 1 (vådvægt). Denne strategi opnåede et højt magnetosomudbytte og produktivitet og indikerer således, at ME-1 har et stort potentiale for storskala produktion af magnetosomer .

lave opløste iltniveauer er blevet etableret empirisk i mange undersøgelser, men uden kontinuerlig måling af opløst iltkoncentration eller definition af dets kontrol i mediet. Heyen og Schristler etablerede en metode til automatisk styring af lav iltspænding (pO2) i MSR-1 dyrkningsmedium ved hjælp af et fermentorsystem til oksystatdrift. pO2-spænding var korreleret med magnetitdannelse. Den laveste registrerede pO2-værdi (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) var den mest gunstige for magnetosomdannelse. Celler dyrket under oksystat betingelser viste signifikant højere magnetit udbytte (6,3 mg L− 1 dag− 1) (Tabel 1).

optagelse af Ferriion

jern er påkrævet som en kofaktor for mange biologiske stoffer, især dem, der er involveret i større biologiske veje. Specifikke jerntransportmekanismer i celler giver jernniveauer, der er tilstrækkelige til optimal vækst. Nogle bakterier producerer jernchelatorer (betegnet sideroforer) for at optage jernjern (Fe3+). Magnetotaktiske bakterier syntetiserer magnetosomer sammensat af magnetit eller greigit efter at have fundet mikroaerofile tilstande, der er egnede til deres vækst . I MSR-1 er magnetit den vigtigste komponent i magnetosomer, og magnetosomproduktion påvirkes derfor ikke signifikant af jerncitrat koncentration i dyrkningsmedium. Jajan et al. , viste, at jernholdigt sulfat var en bedre kilde til jern end jernkvinat og jerncitrat for M. gryphisvaldense . I en undersøgelse af AMB-1, Yang et al. , brugte forskellige jernholdige sulfat og jernchelater som jernkilder og sammenlignede deres virkninger. Magnetosomproduktionen blev signifikant forbedret af jerngallat og sulfat og blev også påvirket af anden jernkilde (jernkvinat, jernmalat) og af jernoptagelseshastighed.

Jernion (Fe3+) optages under dynamisk cellevækst, og den optagne mængde er korreleret med magnetosomdannelse, når opløst iltniveau i medium ikke kan påvises. Magnetosomdannelse kræver mikromolær jernkoncentration og mikrooksiske forhold . MSR-1-celler er ikke-magnetiske under oksiske forhold, men begynder at producere magnetit, når koncentrationen af opløst ilt falder under en tærskelværdi (20 mbar eller ikke detekterbar). I logfasen af cellevækst optages jernion hurtigt, og dets absorptionshastighed er > 80% og korreleret med magnetosomdannelse .

Magnetosomsyntese forbruger ATP

ATP er den universelle energikilde, der kræves til metabolisme, molekylær transport, signaltransduktion og andre afgørende cellefysiologiske processer. Magnetosomsyntese kræver en stor mængde energi, og jernoptagelse afhænger af ATP-tilgængelighed. NADH tilvejebringer en protongradient over den indre mitokondriemembran til ATP-produktion katalyseret af ATP-syntase . NADH / NAD+ – forholdet stiger hurtigt efter magnetosommodning under logfasen.

reducerende effekt øges markant under magnetosomsyntese; imidlertid kan overdreven reducerende effekt hæmme magnetosomsyntese og cellevækst . MSR – 1 kan forbruge overdreven reducerende effekt gennem polyhydroksybutyrat (PHB) syntese og hydrogenfrigivelse . MSR-1-celler indeholder PHB-granuler . Knockout af PHB-syntasegen i MSR-1 resulterede i ~ 30% stigning i magnetosomtal . Energikonkurrence forekommer således mellem PHB og magnetosomsynteseprocessen. En mutant af ATPase-genet af MSR og MSR-NPHB oprettet ved konjugation blev brugt som et genteknologisk værktøj til at demonstrere, at chloramphenicolacetyltransferase (CAT) promotor øger nedstrøms ekspression af ATPase-genet. I sammenligning med MSR-1 viste MSR-NPHB 35% større hydrolyseaktivitet, 71% lavere PHB-akkumulering, 56% større iltforbrug og 40% større laktatforbrug. Det maksimale udbytte af MSR-NPHB i en 7,5-L bioreaktor var 58,4 liter 6,4 mg l-1 . Disse fund viser, at magnetosomudbyttet kan forbedres og produktionsomkostninger og tid reduceres gennem genetisk manipulation af MSR-1 i kombination med optimering/ modifikation af kultur og vækstmedier.

superkildesimutaseaktivitet

Magnetosomsyntese er forbundet med in vitro nedbrydning af H2O2 og med beskyttende virkninger mod H2O2-toksicitet i celler. I mikroorganismer nedbrydes H2O2 og superid-anionradikal (O2 -), som begge har ødelæggende virkninger på cellemakromolekyler . I magnetotaktiske bakterier reducerer superkilte-dismutase også oksidativ stress under magnetosomdannelse. H2O2 kan danne et hydroksylksylradikal efter at have modtaget en elektron fra jernholdigt jern (Fe2+). Det er den reaktive iltart (ROS), der kan skade biomolekyler . Yang et al. , demonstreret, at når der er tilstrækkelig opløst ilt og næringsstoffer til rådighed i sen logfase, er magnetosomdannelse og modning ikke i stand til at indhente celledelingshastigheden, hvilket fører til fortynding af magnetosomer. Reduktion af dismutaseaktivitet kan således skyldes ligheden mellem fortyndet ROS. Magnetosomer, såvel som kunstige magnetiske nanopartikler , deltager i rensning af ROS, og denne aktivitet kan også føre til reduceret superkilte-dismutaseaktivitet.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.