krmení vyvážené živinami

hlavním faktorem ovlivňujícím růst magnetotaktických bakterií a následně tvorbu magnetosomů je koncentrace živin, zejména zdroje uhlíku. Nebylo možné rozšířit optimalizované podmínky média stanovené pro růst MSR-1 v kultuře třepací baňky přímo na fermentorovou kulturu v měřítku hromadné výroby . Během kultury MSR-1 má akumulace nadměrných živin a inhibičních složek v médiu účinky omezující rychlost na růst buněk. Podle Liebigova zákona minima je biomasa v daném systému obvykle omezena množstvím jedné konkrétní živiny, i když jsou přítomny další živiny v přebytku .

živinami vyvážená strategie krmení může snížit inhibiční účinek nadměrného množství živin v médiu. V této strategii je akumulace iontů Na+ a Cl snížena nahrazením zdrojů uhlíku a dusíku. Ve fed-batch kultuře akumulace na+ a CL− iontů snižuje osmotický potenciál a následně inhibuje růst buněk. Dokonce i nízká koncentrace NaCl (40 mM) inhibovala růst buněk . Strategie krmení vyvážená živinami tak může výrazně zvýšit rychlost růstu.

Liu et al. , založil techniku „chemostatové kultury“ pro kultivaci MSR-1 založenou na krmení pH-stat pro udržení konzistence koncentrací dusíku, uhlíku a železa pomocí několika organických kyselin. Mikroaerobní podmínky byly použity pro kultivaci MSR-1 v systému fed-batch autofermentor. Pro podávání pH-statu byl použit živný roztok obsahující (na litr) citrát železitý (4,2 g), kyselinu mléčnou (52,6 g), laktát sodný (129 g) a NH4Cl (54,9 g). Vysoké hodnoty výtěžku magnetosomu (83,23 ± 5,36 mg L− 1) a růstu buněk (55,49 mg L− 1 den-1) byly dosaženy při nízké hladině laktátu sodného (Tabulka 1). Technika chemostatové kultury účinně podporuje výnos magnetosomu a růst buněk s nízkými časovými a energetickými náklady. Cytotoxické účinky byly pozorovány pro nadměrnou koncentraci rozpuštěného kyslíku (≥ 20 ppb) a přítomnost kyseliny mléčné v médiu. Umělé kontrolní strategie pro systémy autofermentoru musí být upraveny s ohledem na fyziologický stav buněk. Podobně Fernández-Castané et al. , demonstroval strategii růstu fed-batch pH-stat. V této strategii byly v krmivu aplikovány různé koncentrace kyseliny mléčné (zdroj uhlíku) a dusičnanu sodného (akceptor elektronů). Růstové podmínky a intracelulární koncentrace železa byly optimalizovány podle koncentrace biomasy. Nejvyšší koncentrace biomasy dosáhla OD565 nm = 15,50 .

Tabulka 1 výtěžek produkce magnetosomů magnetotaickými bakteriemi a jejich podmínky

růst buněk MSR-1 a tvorba magnetosomů jsou vysoké, pokud se jako zdroj uhlíku používá laktát sodný. Na druhé straně je nutná nízká koncentrace laktátu sodného k udržení nízké koncentrace rozpuštěného kyslíku pro rychlý růst buněk a tvorbu magnetosomů . Udržování koncentrace laktátu sodného v hromadném měřítku výroby je obtížné, a proto jsou v laboratoři vyžadovány specifické strategie krmení. Ukázalo se, že NH4Cl je lepším zdrojem dusíku než NaNO3 .

Zhang et al. , dosaženo maximálního výtěžku magnetosomu v MSR-1 pomocí semikontinuální kultivační strategie. Optimalizované baňkové médium bylo použito v 7,5-a 42-L autofermentorech, byla použita strategie krmení vyvážená živinami a byly nahrazeny zdroje uhlíku a dusíku, aby se snížila akumulace iontů Na+ a Cl. Osmotický potenciál byl snížen akumulací na+ a Cl− iontů, čímž se inhibuje výtěžnost magnetosomu a růst buněk. Dosáhli jsme maximálních hodnot ve fed-batch kultuře výtěžku 356 magnetosomů.52 mg L-1 a buněčný růst 9,16 g L-1 (Tabulka 1).

Yang et al. , Kultivované buňky AMB-1 v magnetickém růstovém médiu spirillum (MSGM) obohacené L-cysteinem, kvasinkovým extraktem a polypeptonem. V tomto systému L-cystein zvýšil růst buněk a snížil fázi zpoždění, což má za následek vysokou produkci magnetosomů. Přidání pouze kvasnicového extraktu a polypeptonu vede k mírné produkci magnetosomů. Kvasinkový extrakt nevykazuje žádný významný účinek na produkci magnetosomů, zatímco polypepton pouze zvyšuje konečnou hustotu buněk . Důvod zlepšení produkce magnetosomů L-cysteinem není znám, předpokládá se však, že produkce magnetosomů není spojena s nižšími redoxními potenciály v přítomnosti L-cysteinu . Navíc AMB-1 může růst bez dostupných aminokyselin a cesty syntézy L-cysteinu v AMB-1 nemusí být účinné nebo související s růstem buněk. Proto AMB-1 může přímo použít L-cystein místo toho, aby ho musel syntetizovat pro usnadnění růstu buněk .

Ke et al. , kultivovaný Magnetospirillum sp. ME-1 v růstovém médiu obohaceném octanem sodným, sukcinátem sodným, kvasnicovým extraktem, MgSO4, NH4Cl a citrátem železitým. ME-1 využívá zdroj uhlíku pro růst, jako je sukcinát, fumarát, oxaloacetát, pyruvát, acetát, laktát, malát a pepton. Kromě toho může ME-1 růst v nepřítomnosti zdroje dusíku, avšak suplementace NH4Cl nebo NaNO3 zvyšuje růst ME-1. ME-1 vykazují aktivitu ureázy a oxidázy, což naznačuje schopnost aerobního růstu, aerobní stav však inhibuje tvorbu magnetosomu v ME-1 . Fed-batch fermentace ME-1 byla optimalizována při konstantní úrovni pH 6,8 v 10-L fermentoru na základě pH-statického krmení, při dodávání zdrojů uhlíku, dusíku a železa pro velkovýrobu (Tabulka 1).

navzdory vysokému výtěžku magnetosomů obsahují takové vyvinuté metody růstu magnetotaktických bakterií toxické složky v růstovém médiu. Mezi tyto složky patří karcinogenní, mutagenní a reprotoxické chemikálie, těžké kovy, chelatační činidla a nevyznačující se složky živočišného původu, jako je kvasnicový extrakt . Existuje velká potřeba získat velkovýrobu čistých magnetosomů s co nejnižším množstvím těchto nečistot nebo toxických složek (jiných kovů než železa). Proto Berny et al. , vyvinul minimální růstové médium pro produkci magnetosomů s méně nebo bez toxických složek, a mají podobné vlastnosti magnetosomu jako ty, které byly získány za nejlépe hlášených růstových podmínek Zhang et al. . Za prvé, magnetotaktické bakterie byly amplifikovány v pre-růstovém médiu bez produkce magnetosomů . Ve druhém kroku byly magnetotaktické bakterie poté krmeny médiem s bohatou dávkou železa obsahujícím syntézu magnetosomů . Po 50 h růstu dosáhla koncentrace biomasy na OD565 nm = 8 a výtěžek magnetosomů produkoval asi 10 mg / L růstového média. Bylo pozorováno významné snížení/vymizení složení magnetosomů Zn, Mn, Ba a Al . Tato nová strategie pro výrobu magnetosomů bez nebo s nejnižší koncentrací nečistot jiných než železa, připravuje cestu k lékařským aplikacím.

koncentrace rozpuštěného kyslíku

biosyntéza Magnetosomů vyžaduje mikroaerobní nebo anoxické podmínky. Nízká hladina rozpuštěného kyslíku významně ovlivňuje růst buněk, protože kultura s vysokou hustotou vyžaduje vysoký rozpuštěný kyslík k získání požadovaného výtěžku magnetozomu. Na druhé straně může zvýšený rozpuštěný kyslík zvýšit hustotu MSR-1 v kultivačním médiu, ale inhibovat tvorbu magnetosomů . Existuje tedy konflikt mezi tvorbou magnetosomů a růstem buněk, což ztěžuje současné dosažení vysoké hustoty buněk MSR-1 a vysokého výnosu magnetosomů. Tento konflikt lze vyřešit poněkud regulací rozpuštěného kyslíku na optimální úroveň úpravou rychlosti růstu buněk. Jajan et al. , hlásil sníženou absorpci železa a produkci magnetosomů při hladině rozpuštěného kyslíku nad 5-10 ppm. Nicméně, když rozpuštěný kyslík byl nižší než 5-10 ppm, rychlost absorpce železa a produkce magnetosomů byla zvýšena, což pravděpodobně kvůli pomalému růstu bakterií . Sun a kol. , zavedená masová kultura MSR-1 pro zvýšenou produkci magnetosomů v 42-L fermentoru s optimalizovaným baňkovým médiem, použitím přísných mikroaerobních podmínek (téměř nulová koncentrace rozpuštěného kyslíku) a použitím citrátu železitého a laktátu sodného jako zdrojů železa a uhlíku v médiu. Tato strategie byla účinná pro kultivaci výnosu magnetosomů, protože růst buněk byl regulován při nízké koncentraci rozpuštěného kyslíku, což mělo za následek vysoký výtěžek magnetosomu.

AMB-1 je fakultativní anaerobní magnetotaktická bakterie, která přenáší elektrony dvěma dýchacími cestami. Za podmínek aerobního růstu využívá AMB-1 kyslík jako akceptor elektronů a nepodporuje ani neinhibuje tvorbu magnetických částic. V alternativní dráze používá AMB-1 dusičnan jako akceptor elektronů, a proto vyžaduje nízké redoxní potenciály médií, které vedou k tvorbě magnetozomů. Ve studii Yang et al. , rychlost produkce magnetosomu byla vysoká za nízké koncentrace rozpuštěného kyslíku v kapalné fázi. Když koncentrace rozpuštěného kyslíku v kapalné fázi překročila určitou úroveň (0.20 ppm), respirační dráha se posunula k aerobnímu růstu, což vedlo ke snížení produkce magnetosomů.

koncentrace rozpuštěného kyslíku je silně ovlivněna průtokem vzduchu a rychlostí míchání. Když je rozpuštěný kyslík během počáteční růstové fáze zvýšen zvýšením průtoku vzduchu a rychlostí míchání, výtěžek magnetosomu zůstává nízký, dokud rozpuštěný kyslík neklesne na nedetekovatelnou úroveň. K překonání tohoto jevu při kultivaci MSR-1 musí být rozpuštěný kyslík zvýšen na optimální úroveň mícháním a buňky pak mohou snížit rozpuštěný kyslík dýcháním, dokud nedosáhnou úrovně optimální pro tvorbu magnetozomů. Vysoká produkce magnetosomů byla dosažena optimalizací / úpravou průtoku vzduchu a rychlosti míchání . Během počáteční kultivační fáze byl rozpuštěný kyslík snížen udržováním těchto rychlostí při 1 L min− 1 a 200 ot / min min− 1. Během pozdější kultivační fáze byl rozpuštěný kyslík zvýšen úpravou průtoku vzduchu na 2 L min-1 při 20 h a rychlostí míchání na 300 ot / min min-1 při 28 h. za těchto podmínek buňky rychle rostly, rozpuštěný kyslík se stal nedetekovatelným při 12 h a hustota buněk dosáhla OD565 nm = 12,3 při 36 h. koncentrace laktátu sodného a citrátu železitého byly kontrolovány v rozmezí 3-6 mmol L− 1 a 70-110 µmol L− 1 během procesu. Bylo tedy dosaženo vysokých hodnot výtěžnosti magnetosomu (83,23 ± 5,36 mg L− 1) a produktivity (55,49 mg L− 1 den− 1) (Tabulka 1).

v kultivaci ME-1 byl rozpuštěný kyslík řízen, aby se zvýšila produkce magnetosomu na konstantní úrovni 0,5% vazbou na rychlost proudění vzduchu a rychlost míchání. Během fermentace fed-batch, rychlost míchání (v rozmezí 50-300 ot / min) produkovala velké množství magnetosomů při konstantní úrovni rozpuštěného kyslíku (0,5%). Výsledná hustota buněk a výtěžek magnetosomu při 49 h byly 6,5 (OD565) a 120 mg L− 1 (vlhká hmotnost). Tato strategie dosáhla vysokého výnosu a produktivity magnetosomů, což naznačuje, že ME-1 má velký potenciál pro rozsáhlou produkci magnetosomů .

nízké hladiny rozpuštěného kyslíku byly empiricky stanoveny v mnoha studiích, ale bez kontinuálního měření koncentrace rozpuštěného kyslíku nebo definice jeho kontroly v médiu. Heyen a Schüler zavedli metodu automatického řízení nízkého napětí kyslíku (pO2) v kultivačním médiu MSR-1 pomocí fermentorového systému pro provoz oxystatu. napětí pO2 korelovalo s tvorbou magnetitu. Nejnižší zaznamenaná hodnota pO2 (0,25 mbar; 1 bar = 105 Pa) byla nejpříznivější pro tvorbu magnetozomů. Buňky pěstované za podmínek oxystatu vykazovaly významně vyšší výtěžnost magnetitu (6,3 mg L− 1 den-1) (Tabulka 1).

příjem železitých iontů

železo je vyžadováno jako kofaktor pro mnoho enzymů, zejména těch, které se podílejí na hlavních biologických drahách. Specifické mechanismy transportu železa v buňkách poskytují dostatečné hladiny železa pro optimální růst. Některé bakterie produkují železité chelátory (nazývané siderofory), které zabírají železité železo (Fe3+). Magnetotaktické bakterie syntetizují magnetosomy složené z magnetitu nebo greigitu po nalezení mikroaerofilních podmínek vhodných pro jejich růst . V MSR-1 je magnetit hlavní složkou magnetosomů, a produkce magnetosomů proto není významně ovlivněna koncentrací citrátu železitého v kultivačním médiu. Jajan et al. , ukázalo, že síran železnatý byl pro M. gryphiswaldense lepším zdrojem železa než kvinát železitý a citrát železitý . Ve studii AMB-1, Yang et al. , používal různé síran železnatý a železité cheláty jako zdroje železa a porovnával jejich účinky. Produkce magnetosomů byla významně zvýšena galátem železitým a síranem a byla také ovlivněna jiným zdrojem železa (kvinát železitý, malát železitý) a rychlostí absorpce železa.

železitý iont (Fe3+) je zachycen během dynamického růstu buněk a odebrané množství koreluje s tvorbou magnetosomů, když je hladina rozpuštěného kyslíku v médiu nedetekovatelná. Tvorba magnetosomů vyžaduje koncentraci mikromolárního železa a mikrooxické podmínky . Buňky MSR-1 jsou nemagnetické za oxických podmínek, ale začnou produkovat magnetit, když koncentrace rozpuštěného kyslíku klesne pod prahovou hodnotu (20 mbar nebo Nedetekovatelné). V log fázi buněčného růstu se železitý iont rychle vstřebává a jeho absorpční rychlost je > 80% a koreluje s tvorbou magnetosomů .

syntéza Magnetosomů spotřebovává ATP

ATP je univerzální zdroj energie potřebný pro metabolismus, molekulární transport, přenos signálu a další klíčové buněčné fyziologické procesy. Syntéza magnetosomů vyžaduje velké množství energie a příjem železa závisí na dostupnosti ATP. NADH poskytuje protonový gradient přes vnitřní mitochondriální membránu pro produkci ATP katalyzovanou ATP syntázou . Poměr NADH/NAD + se rychle zvyšuje po zrání magnetosomu během log fáze.

redukční výkon se významně zvyšuje během syntézy magnetosomů; nadměrná redukční síla však může inhibovat syntézu magnetosomů a růst buněk . MSR-1 může spotřebovávat nadměrnou redukční sílu syntézou polyhydroxybutyrátu (PHB) a uvolňováním vodíku . Buňky MSR-1 obsahují PHB granule . Knockout genu PHB syntázy v MSR-1 vedl k ~ 30% zvýšení počtu magnetosomů . K energetické konkurenci tedy dochází mezi PHB a procesem syntézy magnetosomů. Mutant atpázového genu MSR a MSR-NPHB vytvořený konjugací byl použit jako nástroj genetického inženýrství k prokázání, že promotor chloramfenikol acetyltransferázy (CAT) zvyšuje následnou expresi genu ATPázy. Ve srovnání s MSR-1 vykazovala MSR-NPHB o 35% vyšší hydrolýzní aktivitu, o 71% nižší akumulaci PHB, o 56% vyšší spotřebu kyslíku a o 40% vyšší spotřebu laktátu. Maximální výtěžek MSR-NPHB v 7,5 L bioreaktoru byl 58,4 ± 6,4 mg L− 1 . Tato zjištění ukazují, že výtěžek magnetosomu může být zvýšen a výrobní náklady a čas sníženy genetickou manipulací s MSR-1 v kombinaci s optimalizací/ modifikací kultivačních a růstových médií.

aktivita superoxiddismutázy

syntéza Magnetosomů je spojena s rozpadem H2O2 in vitro a s ochrannými účinky proti toxicitě H2O2 v buňkách. V mikroorganismech enzym superoxiddismutáza rozkládá H2O2 a superoxidový aniontový radikál (O2 -−, které mají destruktivní účinky na buněčné makromolekuly . U magnetotaktických bakterií superoxiddismutáza také snižuje oxidační stres během tvorby magnetozomů. H2O2 může tvořit hydroxylový radikál po přijetí elektronu ze železného železa (Fe2+). Hydroxylový radikál je reaktivní druh kyslíku (ROS), který může poškodit biomolekuly . Yang et al. , prokázáno, že pokud je v pozdní log fázi k dispozici dostatek rozpuštěného kyslíku a živin, tvorba a zrání magnetosomů nejsou schopny dohnat rychlost dělení buněk, což vede k ředění magnetosomů. Snížení aktivity superoxiddismutázy tak může být důsledkem podobnosti zředěného ROS. Magnetosomy, stejně jako umělé magnetické nanočástice, se podílejí na úklidu ROS a tato aktivita může také vést ke snížené aktivitě superoxiddismutázy.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.